Th細(xì)胞平衡在雷公藤多苷預(yù)防和治療2型糖尿病腎病中的機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，現(xiàn)已成為導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首位原因，其發(fā)生、發(fā)展與腎小球血流動(dòng)力學(xué)的改變、糖基化終末產(chǎn)物的生成、多元醇代謝通路的異常等因素有關(guān)。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DN的發(fā)生可能與免疫機(jī)制變化引起的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究以高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ

2、)尾靜脈注射構(gòu)建的2型糖尿病和糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型為研究對(duì)象，以雷公藤多苷為治療藥物，探討雷公藤多苷對(duì)大鼠血中1型輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1)/2型輔助性T淋巴細(xì)胞(Th2)細(xì)胞比例及其所分泌的γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)在血中和腎臟中表達(dá)的影響及可能的作用機(jī)制。
　　 方法：清潔級(jí)雄性SD大鼠136只，在無特定病原體級(jí)（SPF級(jí)）條件下飼養(yǎng)

3、，隨機(jī)選取16只作為預(yù)防正常對(duì)照組(PNC)、治療正常對(duì)照組(TNC)，每組8只，飼以常規(guī)飼料;其余120只始終飼以高糖高脂飼料，4周后以尾靜脈注射STZ誘導(dǎo)成T2DM模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為預(yù)防模型組(PDM)、預(yù)防雷公藤多苷干預(yù)低劑量組(PTL，6mg/kg·d)、預(yù)防雷公藤多苷干預(yù)中劑量組(PTM，12mg/kg·d)、預(yù)防雷公藤多苷干預(yù)高劑量組（PTH，24mg/kg·d）;治療模型組(TDM)、治療雷公藤多苷干預(yù)低劑量組

4、（TTL，6mg/kg·d）、治療雷公藤多苷干預(yù)中劑量組（TTM，12mg/kg·d）、治療雷公藤多苷干預(yù)高劑量組(TTH，24mg/kg·d)，每組15只。PNC組及雷公藤多苷預(yù)防組(PDM、PTL、PTM、PTH組)，于成模后開始灌胃，第4周末處死取材;TNC組及雷公藤多苷治療組(TDM、TTL、TTM、TTH組)，則于成模后的第5周開始灌胃治療，第8周末處死取材。PNC、TNC組及PDM、TDM組均以等量的蒸餾水灌胃。觀察大鼠成模

5、前后血糖、體重、灌胃前后24h尿微量白蛋白(Urine microalbumin，UMA)、給藥后肝腎功能、血常規(guī)、血脂等的變化;并于第4、8周末處死動(dòng)物后，通過流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)觀察大鼠外周血CD4+T細(xì)胞中Th1/Th2細(xì)胞比例變化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10水平的變化以及通過RT-PCR和Westem blotting方法分別從基因水平

6、和蛋白水平觀察4種細(xì)胞因子在腎臟的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1)高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后的基礎(chǔ)血糖明顯高于PNC、TNC組(P＜0.05）。STZ注射后高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)，血糖均較造模前明顯升高(P＜0.05）、體重較造模前明顯降低(P＜0.05)、尿微量白蛋白水平自成模后第4周起明顯高于PNC、TNC組（P＜0.05）。
　　 2)與PNC、TNC組相比，

7、PDM、TDM組大鼠UMA、腎重/體重(KW/BW)明顯升高(P＜0.05);與PDM、TDM組相比，雷公藤多苷預(yù)防和治療組中的三個(gè)給藥組UMA、KW/BW有不同程度下降，其中PTM、TTM組下降最明顯（P＜0.05），PTH組降低不明顯(P＞0.05）。
　　 3)一般指標(biāo):雷公藤多苷預(yù)防組和治療組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血肌酐(SCr)和尿素氮（BUN）、血常規(guī)與PNC、TNC組相比無差異(P＞0.05);PTH組大鼠谷草轉(zhuǎn)氨

8、酶(AST)水平明顯升高(P＜0.05);雷公藤多苷治療組中三個(gè)給藥組大鼠血中淋巴細(xì)胞數(shù)(LYM)較TNC組明顯降低(P＜0.05)，但三組間無差異(P＞0.05)。高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后的基礎(chǔ)TG、TC明顯高于PNC、TNC組(P＜0.05）;成模后PDM、TDM組TG、TC亦均較PNC、TNC組進(jìn)一步升高(P＜0.05)，各給藥組TG、TC又較PDM、TDM組有不同程度降低(P＜0.05)，其中PTM、TTM

9、組下降最明顯。
　　 4)流式細(xì)胞術(shù):與PNC、TNC組相比，PDM、TDM組大鼠外周血中Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值明顯升高(P＜0.05)，Th2細(xì)胞比例有不同程度降低;與PDM、TDM組相比，雷公藤多苷預(yù)防和治療組中的三個(gè)給藥組上述指標(biāo)均有不同程度的降低，其中PTM、TTM組Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值下降最明顯(P＜0.05)。
　　 5) ELISA方法:與PNC、TNC組相比，PDM、TDM組大鼠

10、血清IFN-γ、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平有不同程度降低;與PDM、TDM組相比，雷公藤多苷預(yù)防和治療組中的三個(gè)給藥組上述細(xì)胞因子均有不同程度的降低，其中PTM、TTM組IFN-γ、TNF-α下降最明顯(P＜0.05)，PTH組TNF-α降低不明顯（P＞0.05）。
　　 6)RT-PCR方法:與PNC、TNC組相比，PDM、TDM組大鼠腎臟中IFN-γ、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯升高

11、（P＜0.05），IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，IL-4 mRNA表達(dá)水平降低不明顯(P＞0.05);與PDM、TDM組相比，雷公藤多苷預(yù)防和治療組中的三個(gè)給藥組IFN-γ、TNF-αmRNA表達(dá)水平有不同程度降低，IL-4、IL-10 mRNA表達(dá)水平有不同程度的升高，其中PTH組TNF-α mRNA表達(dá)水平降低不明顯(P＞0.05)，IL-4、IL-10升高不明顯(P＞0.05)。
　　 7) Wes

12、tern Blotting方法:與PNC、TNC組相比，PDM、TDM組大鼠腎臟中IFN-γ、TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，IL-10蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，IL-4蛋白表達(dá)水平降低不明顯（P＞0.05）;與PDM、TDM組相比，雷公藤多苷預(yù)防和治療組中的三個(gè)給藥組IFN-γ、TNF-α蛋白表達(dá)水平有不同程度降低，IL-4、IL-10蛋白表達(dá)水平有不同程度的升高，其中PTH組TNF-α蛋白表達(dá)水平降低不明

13、顯(P＞0.05)，IL-4、IL-10升高不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1)成功制備T2DM和DN動(dòng)物模型，大鼠24h尿蛋白特點(diǎn)符合人類2型糖尿病腎病的特征。
　　 2)高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠24h尿微量白蛋白水平、腎重指數(shù)自成模后第4周開始逐漸升高;應(yīng)用低、中劑量雷公藤多苷可以不同程度的降低大鼠尿微量白蛋白水平延緩和治療2型糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，并且具有較高的安全性;高劑量雷公藤多苷可能會(huì)引

14、起肝腎毒性，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥和禁忌癥。
　　 3) T2DM大鼠體內(nèi)存在Th1細(xì)胞比例上調(diào)及其所分泌的促炎細(xì)胞因子增多，以及Th2細(xì)胞比例下調(diào)及其所分泌的抗炎細(xì)胞因子減少介導(dǎo)的遲發(fā)型免疫炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致了DN的發(fā)生和發(fā)展。
　　 4)不同劑量雷公藤多苷可能通過調(diào)節(jié)血中Th1/Th2細(xì)胞比例和其細(xì)胞因子的水平以及改善血脂降低大鼠尿蛋白水平;在腎臟中，雷公藤多苷可能通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕