丙戊酸對胎鼠神經(jīng)干細胞分化及突起生長的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)干細胞（neural stem cells, NSCs）具有多分化潛能，可促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)再生與修復；而神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化是補償受損的神經(jīng)細胞及重建神經(jīng)環(huán)路中的關(guān)鍵，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化的干預成為神經(jīng)干細胞研究亟待解決的關(guān)鍵問題。丙戊酸（valproic acid, VPA)是一種神經(jīng)營養(yǎng)化合物，能促進神經(jīng)元再生、保護神經(jīng)元、促進分化并促進軸突再生，但其誘導神經(jīng)干細胞分化并促進神經(jīng)干細胞

2、來源的神經(jīng)元突起生長的具體機制尚不清楚。本課題通過分離培養(yǎng)E13.5天的胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞，研究VPA對胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞的誘導分化及神經(jīng)干細胞來源的神經(jīng)元突起的作用，并應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125，探討JNK在VPA介導的胎鼠神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化及神經(jīng)干細胞來源的神經(jīng)元突起生長中的作用。
　　方法：
　　本實驗首先對C57BL/6J胎鼠（E13.5天）腦皮層神經(jīng)干細胞進行分離、培養(yǎng)和純化，通過體外培養(yǎng)的

3、形態(tài)學觀察、免疫細胞化學染色來鑒定神經(jīng)干細胞；將第三代神經(jīng)干細胞球傳代后轉(zhuǎn)移到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)孔板中，分化培基進行培養(yǎng)，且實驗組加VPA。利用免疫印跡試驗（Western blot）、免疫細胞化學染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）等技術(shù)，觀察VPA對胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞分化方向及神經(jīng)干細胞來源的神經(jīng)元突起的作用，并進行統(tǒng)計分析，比較神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞的分化比例及神經(jīng)元突起生長情況。同時應(yīng)用JNK的特異性抑制劑S

4、P600125，觀察VPA對胎鼠神經(jīng)干細胞作用的變化，研究JNK在VPA介導的胎鼠神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化及神經(jīng)干細胞來源的神經(jīng)元突起生長中的作用。
　　結(jié)果：
　　實驗成功分離純化C57BL/6J胎鼠（E13.5天）腦皮層神經(jīng)干細胞，通過形態(tài)學觀察、免疫細胞化學染色鑒定，證實其具有神經(jīng)干細胞特性。通過Western blot及細胞免疫熒光染色檢測，證實VPA促進胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的細胞比例及蛋白表達顯著升高

5、，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），而胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞的比例及蛋白表達顯著性降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），少突膠質(zhì)細胞分化的細胞比例與蛋白表達無統(tǒng)計學意義上的改變（P>0.05）；β-Ⅲ-tubulin免疫熒光染色證實，VPA促進神經(jīng)干細胞來源的神經(jīng)元突起總長度、軸突長度、平均長度相比于對照組增大，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001，P<0.001，P<0.001）。應(yīng)用SP600125抑制JNK，V