丙戊酸對(duì)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化及突起生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells, NSCs）具有多分化潛能，可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)再生與修復(fù)；而神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化是補(bǔ)償受損的神經(jīng)細(xì)胞及重建神經(jīng)環(huán)路中的關(guān)鍵，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的干預(yù)成為神經(jīng)干細(xì)胞研究亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。丙戊酸（valproic acid, VPA)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)化合物，能促進(jìn)神經(jīng)元再生、保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)分化并促進(jìn)軸突再生，但其誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞

2、來(lái)源的神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的具體機(jī)制尚不清楚。本課題通過(guò)分離培養(yǎng)E13.5天的胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞，研究VPA對(duì)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元突起的作用，并應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125，探討JNK在VPA介導(dǎo)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化及神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元突起生長(zhǎng)中的作用。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)C57BL/6J胎鼠（E13.5天）腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和純化，通過(guò)體外培養(yǎng)的

3、形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞；將第三代神經(jīng)干細(xì)胞球傳代后轉(zhuǎn)移到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)孔板中，分化培基進(jìn)行培養(yǎng)，且實(shí)驗(yàn)組加VPA。利用免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等技術(shù)，觀察VPA對(duì)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞分化方向及神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元突起的作用，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例及神經(jīng)元突起生長(zhǎng)情況。同時(shí)應(yīng)用JNK的特異性抑制劑S

4、P600125，觀察VPA對(duì)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞作用的變化，研究JNK在VPA介導(dǎo)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化及神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元突起生長(zhǎng)中的作用。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)成功分離純化C57BL/6J胎鼠（E13.5天）腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，證實(shí)其具有神經(jīng)干細(xì)胞特性。通過(guò)Western blot及細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)，證實(shí)VPA促進(jìn)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的細(xì)胞比例及蛋白表達(dá)顯著升高

5、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例及蛋白表達(dá)顯著性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞比例與蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的改變（P>0.05）；β-Ⅲ-tubulin免疫熒光染色證實(shí)，VPA促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元突起總長(zhǎng)度、軸突長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度相比于對(duì)照組增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P<0.001，P<0.001）。應(yīng)用SP600125抑制JNK，V