丙戊酸鈉對(duì)人海馬神經(jīng)前體細(xì)胞分化和凋亡的影響及作用機(jī)制.pdf

1、丙戊酸鈉(valproicacid,VPA)是目前常用的一種主要的廣譜抗癲癇藥物，臨床研究提示其具有較強(qiáng)的神經(jīng)發(fā)育毒性，有胚胎期VPA暴露史的兒童神經(jīng)管畸形、發(fā)育遲緩、智力低下、認(rèn)知障礙和其他行為缺陷的患病率明顯增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，VPA對(duì)腦發(fā)育的一些重要過(guò)程，包括神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移、分化和凋亡等都有影響。然而，臨床研究沒(méi)有或無(wú)法排除癲癇發(fā)作、家庭環(huán)境、潛在的腦發(fā)育異常等因素的干擾，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究具有種屬差異，不能反映藥物在人體的

2、真實(shí)作用，另一方面，二者均無(wú)法在分子水平探討藥物的詳細(xì)作用機(jī)理以及神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用，對(duì)于VPA是否影響人腦發(fā)育及其作用機(jī)理無(wú)法得到全面結(jié)論。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離培養(yǎng)人胚胎腦海馬神經(jīng)前體細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化，研究其在分化過(guò)程中，臨床血藥濃度范圍內(nèi)的VPA(＜1mM)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞分化和凋亡的影響，探討其劑量依賴性，并詳細(xì)研究了星形膠質(zhì)細(xì)胞在VPA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的重要作用。
　　 第一部分人胎腦海馬神

3、經(jīng)前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化
　　 目的：探討人胎腦海馬神經(jīng)前體細(xì)胞(neuralprogenitorcells，NPCs)的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，為體外實(shí)驗(yàn)建立合適的細(xì)胞模型。方法：孕10到14周流產(chǎn)的人胚胎用75％酒精皮膚消毒，取腦，分離海馬，制成單細(xì)胞懸液，置兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，①DMEM/F12，1％N2，2％B27，20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)，2

4、0ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor，EGF)和②DMEM/F12，1％N2，2％B27，20ng/mlbFGF。傳3代后，將神經(jīng)細(xì)胞球接種子24孔板中的涂有多聚賴氨酸(0.1mg/ml)的蓋玻片上，培養(yǎng)液換成含小劑量bFGF的分化液(DMEM/F12，1％N2，2％B27，lng/mlbFGF)，誘導(dǎo)分化。結(jié)果：誘導(dǎo)分化48小時(shí)后神經(jīng)球周邊逐漸有細(xì)胞爬出，遷出的細(xì)胞有兩種形態(tài)，一種是胞體較小、呈圓形或橢

5、圓形、具有1-2個(gè)突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞，另一種是胞體大而扁平的膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，3天后行免疫熒光檢測(cè)證實(shí)前者為β-Ⅲ微管蛋白(β-ⅢTubulin，Tujl)陽(yáng)性的神經(jīng)元，后者為膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。兩種培養(yǎng)基擴(kuò)增的神經(jīng)前體細(xì)胞分化特性很不相同。EGF+bFGF擴(kuò)增的NPCs可分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，其中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞比率約為38.8％和57.3％

6、，bFGF擴(kuò)增的NPCs絕大多數(shù)分化為神經(jīng)元，神經(jīng)元分化比率可達(dá)80％以上，幾乎檢測(cè)不到膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論：1、我們成功分離培養(yǎng)人海馬神經(jīng)前體細(xì)胞，其能自我增殖，并可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，是神經(jīng)前體細(xì)胞；2、EGF+bFGF擴(kuò)增的神經(jīng)前體細(xì)胞可分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，而bFGF擴(kuò)增的神經(jīng)前體細(xì)胞絕大多數(shù)分化為神經(jīng)元；該細(xì)胞模型為我們以后的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分丙戊酸鈉對(duì)人海馬神經(jīng)前體細(xì)胞分化和凋亡的影響及作用

7、機(jī)制
　　 目的：研究丙戊酸鈉(valproicacid，VPA)對(duì)人胚胎腦海馬神經(jīng)前體細(xì)胞分化和凋亡的影響，并探討其誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：將神經(jīng)細(xì)胞球接種于24孔板中的涂有多聚賴氨酸(0.1mg/ml)的蓋玻片上，培養(yǎng)液換成分化液，誘導(dǎo)分化的同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中加入250μM，500μM或lmM的VPA，對(duì)照組不加VPA；分別于作用3天、5天、7天后，免疫熒光標(biāo)記Tjul、GFAP和半胱氨酸蛋白酶-3(caspas

8、e-3)激活片段Asp175的表達(dá)；Hoechst33342標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞核，觀察細(xì)胞核形態(tài)，計(jì)數(shù)凋亡比率；Elisa檢測(cè)上清液中腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的水平；為了探討TNF-α在VPA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，在一些細(xì)胞的分化液中加入500μMVPA的同時(shí)加入TNF-α抗體，或?qū)NF-α50pg/ml和l00pg/ml的加入

9、培養(yǎng)液中，再用Hoechst33342觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果：1、VPA作用后神經(jīng)前體細(xì)胞分化加快，誘導(dǎo)分化24h后即有大量細(xì)胞自神經(jīng)球爬出，3天后遷出的細(xì)胞進(jìn)一步增多，神經(jīng)突起延長(zhǎng)，分支增多，500μM和lmMVPA作用明顯；免疫熒光結(jié)果顯示，在EGF+bFGF擴(kuò)增的NPCs上，VPA作用后神經(jīng)元分化比率明顯增高，而星形膠質(zhì)細(xì)胞分化比率降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，500μM作用最明顯，此時(shí)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞比率分別為59.2％和36.4％

10、（vs對(duì)照組38.8％和57.3％）；在bFGF擴(kuò)增的NPCs上，VPA作用后主要表現(xiàn)為遷出的神經(jīng)元增多，神經(jīng)元突起明顯延長(zhǎng)；2、3天以后，隨著VPA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在EGF+bFGF擴(kuò)增的NPCs上，分化的神經(jīng)細(xì)胞逐漸發(fā)生凋亡，且呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性，而在bFGF擴(kuò)增的NPCs分化成的高純度神經(jīng)元上，VPA并不誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，僅較大濃度lmM作用7天后，神經(jīng)元凋亡輕度增加(15％vs對(duì)照組6％)；3、Hoechst33342和

11、免疫熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，凋亡的細(xì)胞絕大多數(shù)為Tjul陽(yáng)性的神經(jīng)元，caspase-3激活片段Asp175與之共表達(dá)；星形膠質(zhì)細(xì)胞并無(wú)凋亡表現(xiàn)，但細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，胞體增大，細(xì)胞突起明顯延長(zhǎng)，呈現(xiàn)激活狀態(tài)的形態(tài)改變；4、Elisa檢測(cè)上清液中TNF-α和IL-1β的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF擴(kuò)增NPCs產(chǎn)生的高純度神經(jīng)元中，在VPA作用后上清液中未檢測(cè)到TNF-α和IL-1β的分泌，而在EGF+bFGF擴(kuò)增NPCs上，TNF-α水平增高，其水

12、平與細(xì)胞凋亡比率呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，IL-Iβ水平未檢測(cè)到增加；TNF-α抗體能部分阻斷VPA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡作用，凋亡比率在第5天減少了10.0％，第7天減少了17.0％。外源性50pg/ml和100pg/ml的TNF-α加入高純度的神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)其可分別誘導(dǎo)16.0％和30.0％的神經(jīng)元發(fā)生凋亡。結(jié)論：1、VPA對(duì)人胚胎腦神經(jīng)前體細(xì)胞的分化過(guò)程有明顯影響，即加快其分化進(jìn)程，干擾其分化方向，促進(jìn)神經(jīng)元方向的分化，而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化