基于代謝標(biāo)記技術(shù)的糖基化蛋白的富集與鑒定.pdf

1、糖基化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾，糖基化的改變與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，目前臨床上應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物大多為糖鏈或糖蛋白。由于糖肽僅占蛋白酶解肽段很小一部分且糖鏈結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，因此，對復(fù)雜生物體系蛋白質(zhì)的糖基化的分析面臨著巨大挑戰(zhàn)。目前研究N-糖基化的方法已經(jīng)相當(dāng)成熟，而研究O-糖基化的方法存在特異性不高或不能有效鑒定糖基化位點的問題。因此亟待開發(fā)或者優(yōu)化一條高特異性富集、鑒定O-糖肽/蛋白的策略。
　　本文第一部分的研究介紹了

2、一條應(yīng)用末端炔基修飾磁珠富集 P19小鼠畸胎瘤細(xì)胞神經(jīng)分化過程中分泌的O-GalNAc糖基化蛋白的策略。結(jié)果顯示，我們鑒定得到的蛋白數(shù)據(jù)庫中至少包含50個未報導(dǎo)的O-GalNAc糖蛋白，而且在鑒定的O-GalNAc糖基化蛋白中至少有40個與神經(jīng)細(xì)胞的特異性生物學(xué)過程相關(guān)，如軸突生成、神經(jīng)發(fā)育等。結(jié)果表明該策略下，磁珠對復(fù)雜體系中O-糖基化蛋白有一定的富集作用。然而，我們也看到富集的蛋白數(shù)據(jù)庫中有大量的胞內(nèi)蛋白，表明磁珠的特異性有待提高。

3、為此，我們對磁珠表面疏水性結(jié)構(gòu)進(jìn)行了親水性改造，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)改造后磁珠富集能力至少提高40％、靈敏度至少提高10倍，這為后續(xù)復(fù)雜樣品中各類糖蛋白或者糖肽的富集及糖基化位點的鑒定提供了新的工具。
　　第二部分研究是基于目前大量研究表明唾液酸與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為此，我們以四株遺傳背景相同但轉(zhuǎn)移能力存在差異的肝癌細(xì)胞系（MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3和 HCCLM6）為研究對象，探討肝癌細(xì)胞（Hepatocellu

4、lar Carcinoma，HCC）的轉(zhuǎn)移與唾液酸糖基化修飾的關(guān)系。首先，我們驗證了四株細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能依次為97L<97H< LM3< LM6；其次，應(yīng)用凝集素檢測四株細(xì)胞表面α-2,6-唾液酸表達(dá)水平依次為97L>97H>LM3>LM6，暗示四株細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能與其α-2,6-唾液酸修飾呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。接下來，為進(jìn)一步探究可能參與負(fù)調(diào)控HCC轉(zhuǎn)移的唾液酸糖基化蛋白，我們利用糖組學(xué)的方法對四株細(xì)胞膜表面唾液酸糖基化蛋白進(jìn)行富集與鑒定，并篩選出