Sirt1介導RNA結合蛋白QKI的去乙?；陴囸I肝臟能量平衡中的作用.pdf

1、肝臟在饑餓狀態(tài)下的能量平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關鍵作用。饑餓早期,肝臟糖原迅速分解,維持正常的血糖濃度,同時,肝臟的糖異生也開始啟動,一些非糖物質(zhì)經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化后生成葡萄糖,入血后維持血糖濃度和提供能量。隨著饑餓時間的延長,脂肪組織分解,提供甘油和脂肪酸。甘油可以作為糖異生的原料,而脂肪酸能被進一步氧化,為全身能量供應提供支持。肝臟在進行脂肪酸氧化過程中生成酮體,酮體入血后運送到全身多個組織器官為細胞提供能量。因此,肝臟在饑餓的能量平衡中發(fā)揮了核心

2、作用,而這些能量平衡調(diào)控的深層次機制涉及到多種錯綜復雜的分子信號。換句話說,饑餓狀態(tài)下,糖原分解、糖異生、脂肪酸氧化、酮體生成等供能效應,其本質(zhì)是細胞分子信號通路在饑餓環(huán)境下的適應性調(diào)控過程。許多病理條件下,如糖尿病、脂肪肝等疾病,肝臟能量平衡相關信號轉(zhuǎn)導發(fā)生障礙,異常的分子調(diào)控導致了疾病的發(fā)生、發(fā)展。為此,深入研究肝臟代謝分子機制,可以豐富分子代謝理論,同時,為疾病的診治提供新的思路。
　　為適應環(huán)境變化,信號分子在表觀遺傳、轉(zhuǎn)

3、錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等水平的多重調(diào)節(jié)下發(fā)生自身表達和活性的改變,以便適應環(huán)境變化。饑餓時,肝臟中NAD依賴的蛋白去乙?；窼irt1通過翻譯后修飾(去乙酰化)促進PGC1α、FOXO1等代謝相關轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的活性,而活化的轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制增加下游代謝相關酶的表達,促進長期饑餓下肝臟的糖異生和脂肪酸氧化,調(diào)節(jié)血糖的平衡和能量供應?？梢?饑餓環(huán)境下,肝臟細胞中的代謝相關信號分子受到了不同層面的多重調(diào)控

4、。
　　RNA結合蛋白介導的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在肝臟代謝中少有研究。STAR家族成員QKI(Quaking)是一個RNA結合蛋白,由qkI基因編碼,可產(chǎn)生多個異構體,在全身多種組織細胞中表達。其中,QKI5主要定位于胞核,但也能穿梭到胞漿,而 QKI6和QKI7主要分布在胞漿中。通過與mRNA的3'UTR的特異性識別元件(QRE)結合,QKI在調(diào)節(jié)mRNA的胞漿/胞核定位、穩(wěn)定性、翻譯效率等方面發(fā)揮了關鍵作用。在神經(jīng)系統(tǒng),QKI能增加MB

5、P的表達,從而增加髓鞘的形成。在結腸癌中,QKI通過影響β-catenin的亞細胞定位,發(fā)揮抑癌基因效應。我們發(fā)現(xiàn),QKI同樣在肝臟表達,而有關其在肝臟中的功能尚沒有研究報道。
　　【目的】
　　(1)在體內(nèi)和體外模型中,查看 QKI在肝臟饑餓能量平衡過程中的表達變化,分析QKI與糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成的相關性;
　　(2)在體內(nèi)和體外模型中,探討QKI是否受乙?；揎椪{(diào)節(jié),并闡明QKI的乙?；揎椩陴囸I肝臟能量

6、代謝中的作用;
　　(3)分析 QKI乙?；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)分子機制,探討上游調(diào)節(jié)分子如何影響QKI,并在饑餓肝臟代謝中發(fā)揮效應;
　　(4)分析受乙?；揎椪{(diào)節(jié)的QKI通過調(diào)節(jié)哪些下游關鍵分子,從而影響肝臟饑餓能量代謝,并進一步闡明QKI調(diào)節(jié)下游分子的深層次機制。
　　【方法和結果】
　　(1)在小鼠饑餓的肝臟組織、低糖和Forskolin/dexamethasone處理的HepG2細胞中,利用免疫組化、qRT-

7、PCR和Western-blot檢測QKI的表達變化。結果發(fā)現(xiàn),肝臟中,QKI5是主要表達的異構體。與對照相比,QKI5的表達呈現(xiàn)升高的趨勢。
　　(2)在上述饑餓模型中,使用乙酰化抗體進行免疫共沉淀(IP),Western-blot檢測QKI5乙?；?利用生物信息學技術預測QKI5可能的乙?；揎椢稽c;構建乙?；稽c突變的QKI5表達載體,探討乙?；揎椀母淖儗︷囸I肝臟能量代謝的影響。結果表明,QKI5在饑餓的肝臟中表現(xiàn)為去

8、乙?；癄顟B(tài),而使用突變載體干預發(fā)現(xiàn),QKI5的KH domain區(qū)賴氨酸突變?yōu)榫彼?MTR5,乙?；稽c缺失)時,促進肝臟糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成;突變?yōu)楣劝滨０?MTQ5,相當于乙酰化的氨基酸),則抑制糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成。
　　(3)使用去乙?；窼irt1的抑制劑和激活劑,IP試驗檢測肝臟細胞QKI5的乙?；?在細胞中干涉Sirt1的表達,檢測QKI5的乙?；?在Sirt1敲除的小鼠肝臟中查看QKI5的

9、乙?；?。結果表明,在肝細胞中抑制Sirt1的活性,QKI5乙酰化水平增加,促進Sirt1活化,則導致QKI5去乙?；?在干涉Sirt1表達的肝細胞和Sirt1基因敲除的小鼠肝臟組織中,QKI的乙?；蕉际巧叩?。
　　(4)在肝臟細胞中干涉QKI5、過表達QKI5、MTR5、MTQ5,結合饑餓模型刺激,qRT-PCR檢測肝臟代謝相關的關鍵分子的表達。結果發(fā)現(xiàn),干涉QKI5或過表達MTQ5能抑制FOXO1和PPARα表達,而過

10、表達QKI5或MTR5則促進FOXO1和PPARα表達。通過RNA-IP實驗發(fā)現(xiàn),QKI5與FOXO1和PPARα的mRNA有相互作用。
　　(5)通過報告系統(tǒng)實驗進一步驗證QKI5、MTR5和MTQ5對FOXO1和PPARα的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。結果表明,過表達QKI5和MTR5能增加FOXO1和PPARα報告基因的螢光素酶活性,而過表達MTQ5則抑制其活性。
　　【結論】
　　RNA結合蛋白QKI在饑餓肝臟能量代謝中發(fā)