線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位因子Tim50的表達(dá)、純化和前導(dǎo)肽相互作用的研究.pdf

1、線粒體約含有1000種左右的蛋白質(zhì),其中98％以上由核基因編碼,在細(xì)胞質(zhì)核糖體上以前體形式合成,之后再轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體,經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并通過(guò)各種分選機(jī)制定位至線粒體的各部分。線粒體膜間隙蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與線粒體其他部分蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)相比具有其特殊性。依據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和能量來(lái)源不同可以將其分為3類:Ⅰ類蛋白含有一段雙組份分選信號(hào)；Ⅱ類蛋白需要膜間隙的輔助因子協(xié)同折疊；Ⅲ類蛋白含有與膜相互作用的疏水面。研究表明,在線粒體內(nèi)膜和外膜上存在一系列的涉及蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)

2、的蛋白質(zhì)復(fù)合物稱為轉(zhuǎn)位因子(translocator,又稱為translocase),結(jié)構(gòu)上由受體和供蛋白質(zhì)通過(guò)的孔道兩部分構(gòu)成,包括外膜TOM復(fù)合體和SAM復(fù)合體,內(nèi)膜TIM23復(fù)合體、TIM22復(fù)合體和OXA1復(fù)合體。
　　 Tim50在介導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中處于重要地位、發(fā)揮關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)的蛋白質(zhì)在前導(dǎo)肽的牽引下與線粒體外膜上的轉(zhuǎn)位因子TOM復(fù)合體相互作用并進(jìn)入膜間隙,與內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)位因子TIM23復(fù)合體中的Tim

3、23和Tim50的膜間隙結(jié)構(gòu)域復(fù)合物結(jié)合后才能通過(guò)Tim23所形成的膜孔進(jìn)入到線粒體基質(zhì)。因此,Tim50對(duì)于含有前序列的前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體內(nèi)膜是必需的。人源Tim50由353個(gè)氨基酸殘基組成,66-88氨基酸殘基嵌入膜內(nèi),89-353氨基酸殘基構(gòu)成處于外膜和內(nèi)膜的膜間隙的親水性結(jié)構(gòu)域(Tim50IMS)。研究Tim50的結(jié)構(gòu)特性,Tim50與前導(dǎo)肽的相互作用以及其在細(xì)胞中所起的作用對(duì)其基礎(chǔ)理論研究具有重要意義。
　　 本項(xiàng)

4、研究將通過(guò)大量表達(dá)人源Tim50蛋白及其CPD和275結(jié)構(gòu)域蛋白,進(jìn)一步篩選出目的蛋白的表達(dá)、純化的最優(yōu)條件和方法,研究Tim50構(gòu)象的變化和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,Tim50與前導(dǎo)肽的相互作用,生長(zhǎng)蛋白復(fù)合物的晶體,揭示TIM23復(fù)合體在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的分子作用機(jī)制。我們通過(guò)熒光光譜分析等研究結(jié)果表明Tim50膜間隙結(jié)構(gòu)域(Tim50IMS)有穩(wěn)定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu),該蛋白和前導(dǎo)肽相互作用。最后,在此基礎(chǔ)上,生長(zhǎng)了Tim50和前導(dǎo)肽復(fù)合物的晶體