啤酒麥芽極限糊精酶、蛋白抑制因子分離純化及其兩者相互作用的研究.pdf

1、極限糊精酶作為影響生產(chǎn)高發(fā)酵度、淡爽型啤酒的關(guān)鍵因素，在啤酒釀造中起著舉足輕重的作用。本研究對(duì)澳麥201106Gairdner綠麥芽中的極限糊精酶及其抑制因子進(jìn)行了分離純化，并對(duì)其兩者性質(zhì)作了初步研究。同時(shí)，在離體的緩沖液體系中，初步探討了兩者之間的相互作用及還原劑DTT作用結(jié)合態(tài)極限糊精酶釋放自由態(tài)酶的機(jī)制。該研究不僅為獲得較高純度極限糊精酶及其抑制因子提供了有力的理論依據(jù)和可行的工藝方法，亦為國(guó)內(nèi)針對(duì)性地深入研究啤酒麥芽極限糊精酶性

2、質(zhì)提供了豐富的研究材料，還為啤酒糖化過(guò)程實(shí)現(xiàn)酶調(diào)控技術(shù)提供了可靠的理論基礎(chǔ)。
　　采用25％-35%-80%硫酸銨三步鹽析、Sephadex G-25凝膠過(guò)濾柱層析、DEAE sepharose FF離子交換柱層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾柱層析，純化得到麥芽極限糊精酶，經(jīng) SDS-PAGE和 IEF凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶，證明獲得了極限糊精酶純品，分子量大約為101.9kDa，等電點(diǎn)pI約為4.66；將每一步分離純化

3、得到的蛋白質(zhì)樣品，以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)福林-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，同時(shí)以染色底物紅普魯蘭法測(cè)定酶活力，計(jì)算各步驟的比活力、收率和純化倍數(shù)，最終極限糊精酶的純化倍數(shù)為164.2，回收率為16.5%。
　　對(duì)麥芽極限糊精酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，其最適作用溫度為50℃，熱敏感，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，酶活力迅速下降；最適pH在5.5左右，當(dāng)pH低至4.5時(shí)酶活力損失40%以上，在pH5.0-9.0的范圍內(nèi)基本保持穩(wěn)定；此外，Ca2+、Mg2+、

4、Mn2+等金屬離子對(duì)該酶有顯著的激活作用，尤其是工業(yè)中常用的淀粉酶保護(hù)劑Ca2+，在80℃下對(duì)極限糊精酶有良好的保護(hù)作用；對(duì)該酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究表明，以支鏈淀粉為底物，該酶的Km值為3.3426mg/mL，最大反應(yīng)速度 Vmax值為0.8456mg/minmL。
　　采用粗提取、熱提取、羧甲基纖維素CM-52離子交換柱層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾柱層析，純化得到兩種極限糊精酶抑制因子混合物，分子量相近大約為15.8k

5、Da，等電點(diǎn)pI分別約為6.76和7.28，純化倍數(shù)為39.9，回收率為14.1%。
　　對(duì)麥芽極限糊精酶抑制因子的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)極限糊精酶的抑制最適pH近5.5，其在廣泛的pH范圍（pH4.0-8.0）內(nèi)對(duì)極限糊精酶均有抑制作用；在溫暖（40℃）的環(huán)境中，有牛血清白蛋白（BSA）和還原劑DTT存在時(shí)，無(wú)活性的極限糊精酶可恢復(fù)其活性，保溫8h，活性可恢復(fù)約66.5%。
　　在離體條件下對(duì)極限糊精酶調(diào)控機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，在溫