萊鮑迪苷D的生物催化合成及相關糖基轉移酶的結晶條件研究.pdf

1、萊鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）是源自甜葉菊（Stevia Rehaudiana Bertoni）葉片中的四環(huán)二萜類化合物。與其他來自甜葉菊中的主要成分相比較而言，RD不僅保有甜度高（約為蔗糖的200～220倍）、低熱量以及安全無毒的特點，更具有較好的口感、無后苦味，是一種新型甜菊糖類甜味劑。但該類化合物來源稀少，只有甜葉菊Stevia phlebophylla和Stevia rebaudiana兩個品種能夠生產(chǎn)，且其在

2、甜葉菊中含量甚微，僅占干葉的約0.5％。該化合物在植物體內合成的后期是在一系列的葡萄糖基轉移酶的催化作用下完成。本研究一方面對RD微生物異源合成方法進行了研究，期望能夠定向、高效地合成RD；另一方面擬從結構生物學角度去探索RD合成途徑中相關葡萄糖基轉移酶的底物識別機制，基于這些糖基轉移酶多步糖基化修飾過程中對結構高度類似的相關化合物的底物識別機制，這對于未來開發(fā)各種新型糖基化修飾產(chǎn)物具有重要的科學意義。
　　本研究以水稻cDNA為

3、模板，擴增得到葡萄糖基轉移酶基因eugt11，構建了重組菌株E.coli BL21（pETDuet-eugt11），并成功表達了重組蛋白6His-EUGT11。將此重組菌E.coli BL21（pETDuet-eugt11）用于在底物二磷酸尿苷葡糖（Uridine diphosphate glucose，UDPG）存在情況下全細胞催化萊鮑迪苷A（Rebaudioside A， RA）合成RD研究。本研究探討了反應體系pH、溫度、檸檬酸鈉

4、濃度、菌體密度、二價金屬離子、二甲苯體積分數(shù)、UDPG添加濃度對反應效率的影響。單因素考察結果顯示，在菌體密度0.16 g濕細胞/mL反應液，底物RA濃度為1.0 mmol/L，pH=8.0，60 mmol/L檸檬酸鈉，1%（v/v）二甲苯，0.1 mmol/L ZnCl2，12.0 mmol/L UDPG，反應溫度42℃，反應時間1 d的條件下，RD產(chǎn)量為123.6 mg/L（約0.1 mmol/L）。
　　我們然后（第四章工作

5、）涉及對大腸桿菌BL21（DE3）進行了糖配體UDPG代謝通徑改造，獲得了內源性UDPG富集的生產(chǎn)菌株E.coli SG4。以E.coli SG4為宿主表達pYF09質粒上的eugt11基因，獲得高效催化RA生產(chǎn)RD的工程菌E.coli SG4（pETDuet-eugt11）。我們接著探討了反應體系pH、時間、溫度、檸檬酸鈉濃度、菌體量、二價金屬離子、表面活性劑、蔗糖添加濃度對反應效率的影響。單因素考察結果顯示，在菌體量50 mL培養(yǎng)菌

6、液離心所收集菌，底物RA濃度為1.0 mmol/L，pH=8.0，80 mmol/L檸檬酸鈉，1%（v/v）二甲苯，5 mmol/L ZnCl2，50%（w/v）蔗糖，反應溫度42℃，反應時間1 d的條件下，RD產(chǎn)量為1112.21 mg/L（轉化率98.5%）。
　　第五章研究RD合成糖基化過程中有五個關鍵糖基轉移酶（ UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2以及UGT91D2同源的EUGT11），目前這些

7、糖基轉移酶均沒有晶體結構報道，因此首先需要獲得UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2和EUGT11蛋白的晶體，并利用X射線（X-ray）衍射的方法來解析它們的蛋白質結構以及它們與底物復合物的空間結構，以便于找出糖基化位點以及它們與底物的結合區(qū)域。研究工作中將甜葉菊來源的UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2和UGT91D2同源的EUGT11裝載到大腸桿菌表達載體中。將構建好的表達質粒轉化至