神經(jīng)母細胞瘤側(cè)群細胞的干細胞特性鑒定及雌激素和雙酚A對其作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastonm，NB)是小兒最常見的惡性實體腫瘤之一，占兒童期腫瘤的8～10％，其惡性程度高，多數(shù)患兒最終愈后不良，故深入研究NB的發(fā)生、發(fā)展機理至關(guān)重要。我們課題組在對NB的發(fā)生、發(fā)展機理進行研究時發(fā)現(xiàn)：雌激素(estrogen，E)和環(huán)境雌激素雙酚A(bisphenolA，BPA)均能促進神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞株的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，即E和BPA均可促進NB的發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，我

2、們試圖探尋E和BPA對NB起始環(huán)節(jié)的作用，而腫瘤干細胞(cancerstemcell，CSC)即屬于腫瘤的起源細胞，故我們選擇研究“E和BPA對神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞株的CSC的影響”來探尋“E和BPA對NB起始環(huán)節(jié)有無作用”。
　　研究目的：
　　SP(sidepopulation，SP)分析法從神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞株中分離并鑒定出CSC，明確E和BPA干預(yù)對SK-N-SH細胞株的CSC有無影響，最終了解

3、E和BPA對NB的起始環(huán)節(jié)有無作用。
　　材料與方法：
　　一、SK-N-SH細胞株側(cè)群細胞的檢測及檢測條件的優(yōu)化：不同的Hoechst孵育時間、不同的維拉帕米濃度檢測SK-N-SH細胞株的SP細胞(側(cè)群細胞)比例，根據(jù)SP細胞的檢測效果選擇各自的最佳條件；不同濃度Hoechst染色后的表型觀察、CCK-8活細胞數(shù)評定了解Hoechst對SK-N-SH細胞株的毒性；不同濃度Hoechst染色后的流式細胞儀細胞周期分析、Ann

4、exinV-FITC和PI雙標法流式細胞儀凋亡及死亡分析、再培養(yǎng)后SP細胞比例的檢測，探討Hoechst對SK-N-SH細胞株毒性的機理；最后對比不同濃度Hoechst對SK-N-SH細胞株的SP細胞檢測效果，選擇出能有效檢測SP細胞并最低毒性的Hoechst濃度。
　　二、SK-N-SH細胞株側(cè)群細胞的分選及其干細胞特性的鑒定：流式細胞儀于SK-N-SH細胞株中分選出SP細胞和非SP細胞(NSP細胞)；SP和NSP細胞均分別接種

5、于正常生長培養(yǎng)基和干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代，觀察細胞表型的變化；電鏡觀察SP和NSP細胞的超微結(jié)構(gòu)；免疫熒光和免疫印跡法了解SP和NSP細胞的干細胞和分化細胞標志物的表達；CCK-8分析了解SP和NSP細胞的增殖能力；連續(xù)培養(yǎng)的SP和NSP細胞的表型觀察、蛋白標志物表達及流式細胞儀SP細胞比例再檢測了解各細胞亞型的分化潛能；平板克隆實驗、Transwell侵襲實驗、裸鼠成瘤實驗明確SP和NSP細胞的惡性程度。
　　三、雌激素和雙酚

6、A對SK-N-SH細胞株側(cè)群細胞作用的研究：E2和BPA干預(yù)后流式細胞儀檢測SK-N-SH細胞株的SP細胞比例；E2和BPA干預(yù)后免疫印跡法檢測干細胞標志物c-kit和ABCG2蛋白的表達；CCK-8分析和流式細胞周期分析確認E2和BPA對SK-N-SH細胞株的促增殖作用；CCK-8分析了解E2和BPA對SK-N-SH細胞株的SP和NSP細胞各亞型的促增殖作用。
　　結(jié)果：
　　一、SK-N-SH細胞株側(cè)群細胞的檢測及檢測條

7、件的優(yōu)化：60min的Hoechst孵育時間、50μmol/L的維拉帕米濃度可有效于SK-N-SH細胞株檢測出SP細胞；SK-N-SH細胞株特異地對低濃度的Hoechst毒性反應(yīng)敏感，其機理與Hoechst干擾細胞周期、誘導(dǎo)細胞死亡和凋亡有關(guān)；對比不同濃度Hoechst的檢測效果和毒性，最終選擇5μM的濃度用于SK-N-SH細胞株的SP細胞分選；以上述的檢測條件檢測出SK-N-SH細胞株的SP細胞比例為3.6±0.2％。
　　二、

8、SK-N-SH細胞株側(cè)群細胞的分選及其干細胞特性的鑒定：成功于SK-N-SH細胞株中分選出SP和NSP細胞；SP細胞胞體小、有神經(jīng)絲樣突起，貼壁能力弱、集聚性生長，核質(zhì)比高、胞漿細胞器少，高表達干細胞標志物、低表達分化細胞標志物，增殖速度快，具有快速分化能力，克隆形成能力強、侵襲性高、裸鼠成瘤率高；SK-N-SH細胞株的NSP細胞胞體大、無神經(jīng)絲樣突起，貼壁能力強、單層生長，核質(zhì)比低、胞漿細胞器多，低表達干細胞標志物、高表達分化細胞標志

9、物，增殖速度慢，具有緩慢的分化能力，克隆形成能力消失、侵襲性弱、無裸鼠成瘤能力。
　　三、雌激素和雙酚A對SK-N-SH細胞株側(cè)群細胞作用的研究：E2和BPA均能使SK-N-SH細胞株的SP細胞比例下降直至檢測不出、均能下調(diào)干細胞標志物c-kit和ABCG2蛋白的表達；E2和BPA均對SK-N-SH母細胞有顯著的體外促增殖作用，但對其NSP細胞亞型的促殖作用較對其SP細胞亞型更顯著。
　　結(jié)論：
　　1.SP細胞研究時