高糖高脂刺激單核細胞產(chǎn)生微囊泡及初步機制.pdf

1、目的：糖尿病高凝狀態(tài)導致的血栓形成傾向在血管并發(fā)癥中起重要作用，微囊泡(MV)是導致糖尿病高凝狀態(tài)的最新因子，在動脈血栓形成過程中其重要作用，而氧化應激是糖尿病和微囊泡產(chǎn)生的重要共同機制。本研究中以體外培養(yǎng)的THP-1細胞為研究對象，研究2型糖尿病重要的生化特征即高糖和高脂狀態(tài)下單核細胞能否產(chǎn)生微囊泡及其初步機制，為糖尿病血管血栓形成導致血管病變的發(fā)生發(fā)展提供新的理論基礎。
　　 方法：⑴采用ELISA技術檢測高糖高脂刺激THP

2、-1細胞20小時后MV含量，并檢測ERK抑制劑U0126及抗氧化劑NAC預處理1h對高糖高脂刺激THP-1細胞產(chǎn)生MV含量的變化。⑵采用Western Blot技術檢測高糖高脂處理2小時、4小時、6小時后MAPK通路中 p-ERK、ERK、p-p38、p38蛋白表達的變化。⑶采用流式細胞儀檢測高糖高脂處理20小時后細胞凋亡率的變化及高糖高脂處理不同時間后細胞內ROS的變化。
　　 結果：①ELISA結果顯示:與對照組相比，30m

3、M葡萄糖與25μg/mL ox-LDL刺激THP-1細胞20小時后MV產(chǎn)生顯著增多(P＜0.01);抗氧化劑NAC預處理1h后高糖+NAC組MV含量明顯低于高糖組（P＜0.01），高脂+NAC組MV含量也明顯低于高脂組(P＜0.01); ERK抑制劑U0126預處理1h后高糖+U0126組MV含量與高糖組無明顯變化(P＞0.05)，高脂+U0126組MV含量與高脂組也無明顯變化(P＞0.05)。②Western Blot結果顯示:與對照

4、組相比，隨高糖刺激時間延長ERK、p38蛋白磷酸化水平均明顯升高(P＜0.01)。其中，p38蛋白的磷酸化，在4h作用最強。與對照組相比，高脂刺激4h后ERK蛋白磷酸化水平明顯升高(P＜0.01);對于p38蛋白的磷酸化，高脂刺激2h、4h后均有增加(P＜0.01)。其中，對于ERK蛋白的磷酸化，在4h作用最強;對p38蛋白的磷酸化，則在2h作用最強，而后隨時間延長4h（P＜0.01）、6h（P＞0.05）逐漸減少。③流式細胞儀檢測細胞

5、凋亡率:與對照組相比，30mM葡萄糖與25μg/mL ox-LDL處理20小時后，細胞凋亡率明顯增高(P＜0.01)。④流式細胞儀檢測細胞內ROS結果:30mM葡萄糖刺激THP-1細胞2h后，ROS的產(chǎn)生達高峰，達對照組的約3倍，而后隨時間的延長呈逐步遞減趨勢，至24h均高于對照組（P＜0.01），在48h回落至基線水平。25μg/ml ox-LDL刺激THP-1細胞2h，ROS的產(chǎn)生達到高峰，約為對照組7倍，而后隨時間的延長呈逐步遞減