肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A在高糖誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)論文進(jìn)行探討：
　　論文1 肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A在高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞致細(xì)胞外基質(zhì)重塑中的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　1.研究MEF2A在心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，觀察高糖導(dǎo)致的MEF2A表達(dá)及定位的變化。
　　2.探討MEF2A干擾對(duì)高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增值、遷移、向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、膠原合成能力及基質(zhì)金屬蛋白酶活性(MMP)-組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)平衡的影響。

2、>　　3.探討MEF2A對(duì)高糖狀態(tài)下的心臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生影響的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.慢病毒shRNA-MEF2A載體構(gòu)建
　　設(shè)計(jì)3對(duì)MEF2A基因的shRNA質(zhì)粒，用RT-PCR和蛋白印跡法分析干擾效率，選擇干擾效率最高的序列裝載包含綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因的慢病毒載體。MEF2A的目標(biāo)干擾序列(ShRNA-MEF2A)為:5'-GCTTGCCACCTCAGAACTTCT-3'，陰性對(duì)照序列(shRN

3、A-NC)為:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。
　　2.心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)
　　從1至3天新生小鼠心室組織中提取心臟成纖維細(xì)胞，并用梯度貼壁法純化，用免疫熒光檢測(cè)Vimentin以評(píng)估其純度，免疫熒光檢測(cè)VWF排除內(nèi)皮細(xì)胞的污染。以正常糖濃度及相同滲透壓培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照，應(yīng)用不同時(shí)間(6h、12h、24h、48h、72h)的高糖刺激細(xì)胞，觀察其MEF2A的表達(dá)。ShRNA-MEF2A慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)

4、胞后再加高糖干預(yù)，觀察其對(duì)心臟成纖維細(xì)胞各種應(yīng)對(duì)功能的影響。
　　3.細(xì)胞免疫熒光
　　應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)成纖維細(xì)胞中MEF2A及磷酸化的MEF2A(p-MEF2A)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的分布及表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.高糖使心臟成纖維細(xì)胞中MEF2A表達(dá)增加，并使MEF2A由細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位。
　　與正常糖對(duì)比，33 mM高糖刺激心臟成纖維細(xì)胞，MEF2A表達(dá)6h升高，48h達(dá)高峰。滲透

5、壓組及對(duì)照組無明顯變化。免疫熒光及Western blot檢測(cè)顯示，高糖使MEF2A表達(dá)從細(xì)胞核向細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)移，而p-MEF2A始終存在于細(xì)胞核中，但表達(dá)增高。
　　2.MEF2A抑制減少高糖導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞增殖，而對(duì)凋亡無影響
　　CCK-8檢測(cè)顯示，與高糖組比較，MEF2A抑制明顯抑制各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上高糖導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖核標(biāo)記物EdU染色檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞經(jīng)shRNA-MEF2A慢病毒載體轉(zhuǎn)染及高糖干預(yù)48h后

6、增殖情況，結(jié)果也顯示高糖組較對(duì)照組及OC組細(xì)胞增殖增加，而MEF2A干擾使高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖明顯減輕。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)MEF2A抑制沒有影響成纖維細(xì)胞的凋亡。
　　3.MEF2A抑制限制高糖導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞遷移
　　劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEF2A慢病毒轉(zhuǎn)染后高糖干預(yù)12h、24h、36h、48h后心臟成纖維細(xì)胞的遷移情況，Transwell檢測(cè)MEF2A慢病毒轉(zhuǎn)染后高糖干預(yù)48h后遷移至小室的心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量，兩者結(jié)果都顯示:與

7、對(duì)照組比較，高糖明顯增加成纖維細(xì)胞的遷移，與高糖組對(duì)比，MEF2A抑制明顯減少高糖導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞遷移。
　　結(jié)論：
　　1.高糖使心臟成纖維細(xì)胞中MEF2A表達(dá)增加，并向細(xì)胞質(zhì)彌散，使p-MEF2A表達(dá)增加。
　　2.MEF2A抑制減輕高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增值、遷移、向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、MMP-TIMP平衡及膠原分泌。
　　3.下調(diào)MEF2A抑制高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞功能改變的機(jī)制可能與抑制Akt和TGF-β1/

8、Smad信號(hào)通路相關(guān)。
　　論文Ⅱ 肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A部分通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響糖尿病心肌病心臟纖維化的研究及機(jī)制探討
　　目的：
　　1.研究MEF2A對(duì)高糖誘導(dǎo)的EndMT的影響;
　　2.探討MEF2A調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的EndMT的分子機(jī)制。
　　3.體內(nèi)研究MEF2A對(duì)糖尿病導(dǎo)致的心臟纖維化及心臟功能的影響。
　　4.體內(nèi)研究MEF2A敲除對(duì)心臟內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的影響。
　　5.

9、探討MEF2A是否通過調(diào)節(jié)EndMT影響糖尿病心肌病的纖維化及心臟功能。
　　方法：
　　1.構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的MEF2A干擾載體
　　慢病毒載體包括綠色熒光蛋白報(bào)告基因和MEF2A干擾的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:
　　采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為研究對(duì)象;細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮標(biāo)記物CD31和VE-Caderin的表達(dá)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞是否為HUVECs。
　　3.細(xì)胞內(nèi)基因干預(yù):

10、r>　　體外實(shí)驗(yàn)，以33 mmol/L右旋葡萄糖刺激，5mmol/L葡萄糖作為對(duì)照，觀察HUVECs在高糖狀態(tài)下的反應(yīng)。采用慢病毒轉(zhuǎn)染MEF2A shRNA的方式抑制MEF2A的基因表達(dá);用p38MAPK抑制劑預(yù)先處理，抑制p38MAPK磷酸化;應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Smad2-siRNA的方式抑制Smad2的基因表達(dá)。
　　4.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）
　　CO-IP檢測(cè)HUVECs內(nèi)M

11、EF2A和Smad2在高糖狀態(tài)下的相互作用。
　　5.Duolink原位-鄰位鏈接技術(shù)檢測(cè)
　　Duolink原位-鄰位鏈接技術(shù)檢測(cè)HUVECs內(nèi)MEF2A和Smad2在高糖狀態(tài)下的相互作用。
　　結(jié)果：
　　1.HUVECs細(xì)胞鑒定及MEF2A慢病毒干擾效率評(píng)估
　　細(xì)胞免疫熒光顯示所有細(xì)胞CD31均呈陽性，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為HUVECs。綠色熒光蛋白(GFP)代表其轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％以上，RT-PCR及We

12、stern blot分別分析其干擾效率達(dá)30％以上。
　　2.MEF2A干擾抑制HUVECs高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)
　　HUVECs轉(zhuǎn)染病毒后經(jīng)高糖干預(yù)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化顯示:高糖使細(xì)胞有圓形或橢圓形向長梭形轉(zhuǎn)變，而MEF2A干擾阻止高糖誘導(dǎo)的這種形態(tài)改變發(fā)生。免疫熒光檢測(cè)顯示高糖明顯增加FSP1和α-SMA等間充質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)，而使內(nèi)皮標(biāo)記物CD31和VE-Cadherin等內(nèi)皮標(biāo)記物表達(dá)減少，并且

13、可以觀察到CD31和FSP1，CD31和α-SMA同時(shí)表達(dá)的細(xì)胞，而MEF2A干擾使這種高糖誘導(dǎo)的標(biāo)記物表達(dá)變化減輕，使內(nèi)皮及間充質(zhì)標(biāo)記物同時(shí)表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)減少。Western blot結(jié)果和免疫熒光結(jié)果相一致:高糖使CD31和VE-Cadherin表達(dá)降低，F(xiàn)SP1、α-SMA和vimentin表達(dá)升高，MEF2A干擾使高糖誘導(dǎo)的各標(biāo)記物變化減輕。
　　3.HUVECs中高糖導(dǎo)致的EndMT受MEF2A向胞漿轉(zhuǎn)位和與p38MA

14、PK和Smads相互作用的調(diào)節(jié)
　　免疫熒光和Western blot分析顯示高糖使MEF2A在HUVECs的胞漿中表達(dá)增加，對(duì)p-MEF2A的定位無影響，使表達(dá)增加。 Western blot檢測(cè)顯示用SB203580阻止p38的磷酸化可以減少高糖誘導(dǎo)的MEF2A，p-MEF2A和EndMT標(biāo)記物的表達(dá)變化。
　　CO-IP檢測(cè)顯示MEF2A和Smad2之間存在相互作用。而PLA顯示MEF2A和Smad2的相互作用在對(duì)照組

15、發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，在高糖組中發(fā)生在細(xì)胞漿中。Western blot分析顯示，與對(duì)照組比較，高糖增加Smad2的磷酸化水平，而MEF2A干擾使其高糖誘導(dǎo)的磷酸化水平降低。Smad2被si-RNA干擾后，高糖誘導(dǎo)的MEF2A、FSP-1和α-SMA表達(dá)降低，CD31和VE-Cadherin表達(dá)升高。
　　4.心肌內(nèi)注射shRNA-MEF2A干擾病毒使糖尿病小鼠心肌中MEF2A表達(dá)降低
　　RT-PCR和western blot分

16、析評(píng)估對(duì)照組及糖尿病小鼠經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾后MEF2A mRNA和蛋白的表達(dá)情況。MEF2A干擾組較干擾對(duì)照組mRNA和蛋白表達(dá)降低都在30％以上。
　　5.MEF2A干擾對(duì)各組小鼠血糖、體重、心臟重量和心體比的影響
　　STZ注射21周后，小鼠血糖、體重、心臟重量和心體比被測(cè)量。和對(duì)照組相比，糖尿病組小鼠的體重和心臟重量都降低，但心體比值增加。和shRNA-MEF2A對(duì)照組比較，shRNA-MEF2A干擾組小鼠的心臟重量和心

17、體比值降低，體重?zé)o明顯變化。這些變化說明MEF2A干擾能夠影響糖尿病誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖使HUVECs的MEF2A表達(dá)升高，并使其發(fā)生由細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位。
　　2.MEF2A抑制可減輕高糖誘導(dǎo)的HUVECs的EndMT。
　　3.MEF2A干擾抑制EndMT發(fā)生可能是通過其發(fā)生轉(zhuǎn)位及與p38MAPK和Smads相互作用的調(diào)節(jié)。
　　4.糖尿病小鼠心肌組織MEF2A干擾可改善心臟重構(gòu)、