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文檔簡(jiǎn)介
1、microRNA(miRNA)是與轉(zhuǎn)錄后基因沉默相關(guān)的一類長(zhǎng)度為21-23nt的重要RNA,最早在秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)?,F(xiàn)已證實(shí),miRNA廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi),是最大的基因家族之一,約占整個(gè)基因組的1%-4%。最近研究表明,miRNA功能廣泛,在生物體內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程和調(diào)控途徑中扮演著關(guān)鍵性角色,如發(fā)育進(jìn)程控制、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化與器官發(fā)育、病毒感染、維持機(jī)體生理活動(dòng)
2、的動(dòng)態(tài)平衡等。它們通過(guò)依賴于miRNA和靶基因的互補(bǔ)性的兩種不同的機(jī)制反向調(diào)控靶基因的表達(dá)。當(dāng)miRNAs和編碼蛋白質(zhì)的mRNA幾乎完全配對(duì)時(shí),miRNAs誘導(dǎo)RNA介導(dǎo)(RNAi)的干擾途徑;當(dāng)這些miRNAs通過(guò)不完全的堿基配對(duì)和mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTRs),在一個(gè)類似于或者可能是等同于RNA干擾途徑中使用的RISC復(fù)合物中,在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因翻譯。迄今為止,miRNA的研究工作主要集中在三個(gè)方向:1)miRNA的克隆和鑒
3、定;2)miRNA的功能研究;3)miRNA的表達(dá)調(diào)控。其中,miRNA的表達(dá)調(diào)控的研究近年來(lái)發(fā)展迅速,引起了廣泛關(guān)注。
miR-122是一個(gè)肝臟特異性高表達(dá)的microRN。它除了在精子發(fā)生過(guò)程中有短暫低量表達(dá)以外,其他情況下都在肝臟保持著組織特異性的高表達(dá)。隨后的功能研究發(fā)現(xiàn),miR-122主要參與了以下幾個(gè)方面的生物學(xué)事件:1)miR-122對(duì)于維持HCV的復(fù)制有重要作用;2)miR-122參與精子發(fā)生過(guò)程;3)mi
4、R-122參與脂類代謝過(guò)程;4)miR-122與肝癌發(fā)生有關(guān)。然而,對(duì)于miR-122如何實(shí)現(xiàn)肝臟特異性的高表達(dá)以及如何在脂類代謝過(guò)程中進(jìn)行自身調(diào)節(jié)以保持脂類代謝的動(dòng)態(tài)平衡我們還知之甚少。
本研究以人miR-122為研究對(duì)象,探索miR-122肝臟特異性高表達(dá)及在脂類代謝過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。首先對(duì)人miR-122的基因組定位、進(jìn)化保守性、前體可能的產(chǎn)生過(guò)程以及邊界進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析。然后,利用Northern blo
5、t、RT-PCR和RACE對(duì)miR-122前體pri-miR-122進(jìn)行分析;利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)研究pri-miR-122的染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄機(jī)器;利用報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)合生物信息學(xué)分析以及序列刪除和突變技術(shù)確定pri-miR-122的啟動(dòng)子區(qū)域以及可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)和RNA干擾(RNAi)技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miR-122的調(diào)
6、控作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):人miR-122基因位于一個(gè)肝臟特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi),是由一個(gè)較長(zhǎng)的前體非編碼基因轉(zhuǎn)錄本通過(guò)剪切后而產(chǎn)生。這個(gè)前體轉(zhuǎn)錄本在進(jìn)化上序列保守性不高,但其啟動(dòng)子區(qū)具有相當(dāng)高的保守性。miR-122前體轉(zhuǎn)錄本包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子,具有一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的3’-UTR,而miR-122莖環(huán)結(jié)構(gòu)就位于其中。miR-122前體基因啟動(dòng)子區(qū)位于miR-122保守莖環(huán)序列上游約5kb處,包含多個(gè)核受體因子結(jié)合序列如DR順式元件和明顯
7、的RNA聚合酶Ⅱ所識(shí)別的啟動(dòng)子順式元件如TATA-box和CCAAT-box等,利用報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)合生物信息學(xué)分析以及序列刪除和突變技術(shù)鑒定了這些元件對(duì)于miR-122基因表達(dá)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。對(duì)上述元件進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析,推測(cè)在該啟動(dòng)子區(qū)可能存在多個(gè)與脂代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),如HNF4、PPARα和FOXO家族等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。我們首先利用報(bào)告基因系統(tǒng)確定了HNF4對(duì)該啟動(dòng)子具有明顯的正調(diào)控作用,當(dāng)潛在的HNF
8、4結(jié)合位點(diǎn)被突變后,再進(jìn)行報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),HNF4的正調(diào)控作用明顯下降,與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。隨即我們利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)對(duì)Huh7細(xì)胞內(nèi)源HNF4富集的片段利用針對(duì)該啟動(dòng)子的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn),當(dāng)在Huh7細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)HNF4轉(zhuǎn)錄因子時(shí),miR-122的前體與成熟序列的表達(dá)都發(fā)生了比較明顯的上調(diào),而利用可以抑制HNF4表達(dá)的藥物PMA[8]對(duì)Huh7進(jìn)行處理后,miR-122的表達(dá)發(fā)生了明顯的下調(diào),說(shuō)明HNF4對(duì)于miR-
9、122的正常表達(dá)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。另外,我們利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)miR-122的潛在靶基因進(jìn)行了篩選。根據(jù)sanger研究所miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù),我們首先對(duì)miR-122的所有潛在靶基因進(jìn)行了初步分析,其中與代謝相關(guān)的重要酶類占了相當(dāng)大的比例。然后通過(guò)將表達(dá)miR-122的載體與在熒光素酶報(bào)告基因3’下游含有miR-122潛在靶基因的完整3’UTR區(qū)的載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并設(shè)立嚴(yán)格的對(duì)照,驗(yàn)證了miR-122
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