IL-lβ在肺成纖維細胞表達ICAM-1中的作用研究.pdf

1、目的：本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)Wistar大鼠肺成纖維細胞，采用免疫細胞化學(xué)染色法測定細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在肺成纖維細胞上的表達部位、RT-PCR方法測定ICAM-1 mRNA表達水平，觀察不同濃度IL-1β在不同時間點對肺成纖維細胞表達ICAM-1mRNA的影響。
　　方法：采用組織切塊法對大鼠胚肺成纖維細胞的培養(yǎng)：將Wister臨產(chǎn)孕鼠行乙醚吸入麻醉后

2、，立即取出Wister胎鼠，將胎鼠肺組織剪成1mm×1mm×1mm大小的小塊，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，一周左右待細胞鋪滿瓶底后傳代，用第5～6代形態(tài)、結(jié)構(gòu)一致貼壁生長的肺成纖維細胞進行實驗。將實驗分為三大組：
　　(1)對照組：只應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細胞6h。
　　(2)不同濃度的IL-1β組：①應(yīng)用含IL-1β(0.5ng/ml)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細胞；②應(yīng)用含IL-1β(5ng/ml)的

3、DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細胞；③應(yīng)用含IL-1β(15ng/ml)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細胞。以上各組均培養(yǎng)6h。
　　(3)同一濃度IL-1β不同時間組：應(yīng)用同樣濃度IL-1β(15ng/ml)對肺成纖維細胞細胞進行不同時間(0h、2h、4h、6h、12h、24h)的培養(yǎng)，分為對照組、2h組、4h組、6h組、12h組、24h組。
　　用免疫細胞化學(xué)染色法觀察ICAM-1在肺成纖維細胞上的表達部位，采用RT-PCR法

4、測定肺成纖維細胞中ICAM-1 mRNA表達水平。以上各組實驗重復(fù)6次。
　　結(jié)果：
　　1成功培養(yǎng)Wistar胎鼠原代肺成纖維細胞：本實驗通過應(yīng)用組織切塊法培養(yǎng)Wistar胎鼠肺成纖維細胞，培養(yǎng)5～10h后倒置顯微鏡下即觀察到圓形的細胞從組織塊周圍游走出來，經(jīng)1周左右，這種圓形細胞逐漸變成橢圓、菱形，并成放射狀，足變長，相鄰細胞融合，互相連接，細胞核大而圓，明亮。經(jīng)2～3次胰酶消化純化后，遺留的組織塊、紅細胞、上皮細胞等逐

5、漸被清除，剩下形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)一致的肺成纖維細胞(細胞形態(tài)一致，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核仁清晰，可見核分裂相，生長狀況良好)，為理想的肺成纖維細胞實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　2 ICAM-1在肺成纖維細胞的表達部位
　　正常肺成纖維細胞ICAM-1表達呈弱陽性，以胞膜為主，包漿偶有表達，胞核無表達；ICAM-1在肺成纖維細胞膜被染成棕黃色顆粒。IL-1β(15ng/mL)干預(yù)后，其胞膜的陽性顆粒顏色明顯變深、增多。
　　3 RT

6、-PCR方法測定肺成纖維細胞ICAM-1mRNA表達水平的變化
　　各實驗組在234bp處均出現(xiàn)了特異性的ICAM-1mRNA條帶，576bp處出現(xiàn)了內(nèi)參Ratβ-actin的特異片段。ICAM-1mRNA電泳條帶的光密度掃描顯示，對照組ICAM-1mRNA有一定量的基礎(chǔ)表達，但表達量甚低(0.112±0.02)。在培養(yǎng)液中加入不同濃度IL-1β(0.5ng/mL、5ng/mL、15ng/mL)培養(yǎng)6h后，ICAM-1mRNA的表

7、達量分別為0.368±0.02、0.736±0.03、0.805±0.02，與對照組相比均明顯升高(P＜0.01)，并且ICAM-1mRNA的表達水平隨著IL-1β濃度的增加而逐漸升高，IL-1β不同濃度組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　同一濃度IL-1β(15ng/mL)刺激下，對照組、2h組、4h組、6h組、12h組、24h組ICAM-1mRNA的表達水平分別為0.137±0.013、0.466±0.01、0.

8、672±0.09、0.872±0.03、0.678±0.021、0.502±0.07，結(jié)果顯示盡管IL-1β的濃度相同但是刺激時間不同時，ICAM-1mRNA表達水平并不相同，表現(xiàn)為刺激2h后出現(xiàn)升高(P＜0.01)，6h達高峰(P＜0.01)，8h逐漸下降趨勢，隨著時間的推移，未再出現(xiàn)進一步升高，在24h仍高于對照組。各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1本實驗應(yīng)用組織切塊培養(yǎng)法，成功獲得