基于MC-Tryptase-PAR-2-Rho-FLS信號(hào)途徑探討資木瓜總苷抗RA的作用機(jī)制.pdf

1、目的：研究資木瓜總苷抑制肥大細(xì)胞（Mast cell,MC）活化，促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)凋亡，減輕滑膜炎性增生及關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）作用機(jī)制。
　　方法：分離小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨髓源性肥大細(xì)胞mBMMCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD117和 FcεRIα雙陽(yáng)性表達(dá)，甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定，電鏡觀察細(xì)胞顯微

2、結(jié)構(gòu)；CCK-8和MTT法檢測(cè)不同濃度資木瓜總苷對(duì)肥大細(xì)胞的毒性；β-己糖胺酶（β-hexosaminidase）法檢測(cè)mBMMCs活化脫顆粒情況, ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中類胰蛋白酶（Tryptase）含量；分離小鼠關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞培養(yǎng)鑒定，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FLS細(xì)胞膜受體PAR-2的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)、Western blot法檢測(cè)FLS細(xì)胞的凋亡情況；Pull-down法檢測(cè)FLS細(xì)胞中活化的Rho-GTP酶水平， Wester

3、n blot法分析活化的Rho-GTP酶中Rho蛋白水平。
　　結(jié)果：（1）資木瓜總苷可顯著降低經(jīng)DNP-BSA，A23187，和SCF體外刺激RBL-2H3和mBMMC肥大細(xì)胞β-hexosaminidase的釋放率（ P<0.01）；資木瓜總苷可顯著抑制mBMMC類胰蛋白酶的釋放(P<0.01)；而且資木瓜總苷抑制肥大細(xì)胞表面FcεRIα的表達(dá)和胞內(nèi)蛋白Lyn與 PLCγ1的磷酸化。（2）外源性的類胰蛋白酶（Tryptase）

4、顯著提高成纖維樣滑膜細(xì)胞表面PAR-2的表達(dá)，顯著活化Rho激酶（P<0.05），從而顯著抑制CH11誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡(P<0.05)；而資木瓜總苷對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞無(wú)直接作用。（3）資木瓜總苷處理后的mBMMC上清可降低成纖維樣滑膜細(xì)胞表面的PAR-2受體的表達(dá)，進(jìn)而抑制活化的Rho表達(dá)，顯著促進(jìn)Fas介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡(P<0.05)；（4）肥大細(xì)胞與成纖維樣滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，資木瓜總苷處理后，可顯著抑制活化

5、的Rho表達(dá)（ P<0.05），顯著促進(jìn)Fas介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡(P<0.05)，而加入PAR-2阻斷劑后這種作用顯著減弱。
　　結(jié)論：（1）資木瓜總苷可顯著抑制經(jīng)抗原刺激的肥大細(xì)胞活化脫顆粒；資木瓜總苷抑制肥大細(xì)胞的活化機(jī)制可能會(huì)通過(guò)FcεRIα-Lyn-PLCγ1通路實(shí)現(xiàn)。（2）肥大細(xì)胞來(lái)源的類胰蛋白酶可作用于成纖維樣滑膜細(xì)胞表面PAR-2受體進(jìn)而活化Rho激酶，抑制Fas介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡；（3）資木瓜總苷可