PMPs對Ra-FLS遷移和侵襲的影響及機制探討.pdf

1、目的:血小板微顆粒(PMPs)是血小板活化過程中形成的囊性小泡，含有細胞因子、白介素、趨化因子等多種生物活性物質(zhì)。研究顯示PMPs所具有的生物膜囊性結(jié)構(gòu)，能夠協(xié)助這些生物活性物質(zhì)作用于靶細胞進而放大細胞間信號傳遞的級聯(lián)反應(yīng)，因而與包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)在內(nèi)的多種炎性、自身免疫性疾病有關(guān)。有報道認為PMPs能夠加強多種腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，而RA成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)遷移和侵襲能力的增強是RA關(guān)節(jié)破壞的重要環(huán)節(jié)。因此認為P

2、MPs有可能通過促進RA-FLS的遷移和侵襲，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。本研究的目的是觀察PMPs對人RA-FLS細胞株(MH7A)遷移和侵襲的影響，并初步探究PMPs調(diào)控RA-FLS遷移和侵襲的機制。
　　方法:
　　1、使用二磷酸腺苷(ADP)活化血小板，離心收集純化PMPs，并使用流式細胞儀以PE標(biāo)記的鼠抗人CD41抗體檢測所提取PMPs的純度。
　　2、使用細胞劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗研究P

3、MPs對RA-FLS遷移的影響。
　　3、使用Transwell細胞侵襲實驗研究PMPs對RA-FLS侵襲的影響。
　　4、使用RA-FLS與Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel進行細胞與ECM黏附實驗研究PMPs對RA-FLS與ECM黏附的影響。
　　5、使用基因芯片高通量分析研究PMPs作用后RA-FLS表達譜的變化。使用RT-qPCR從mRNA水平檢測PMPs對基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2

4、(MMP2)表達產(chǎn)生的影響。
　　6、使用Western blot方法研究MMP1蛋白水平表達的變化，并檢測PMPs處理48小時后，RA-FLS中p-I-κ B和p-NF-κ B水平以及p-Erk和p-Akt水平的改變以探究PMPs激活NF-κ B通路的可能途徑。
　　結(jié)果:
　　1、PMPs純度約為93.4％，可用于后續(xù)細胞水平的實驗。
　　2、細胞劃痕實驗中25μg/ml PMPs組RA-FLS的愈合速度快于

5、對照組，50μg/ml PMPs組又快于25μg/ml PMPs組。Transwell細胞遷移實驗顯示對照組每100倍視野下平均穿過29.6±4.5個細胞，25μg/ml PMPs組穿過62.4±7.2個細胞，50μg/ml PMPs組穿過175.1±10.6個細胞，實驗組與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3、Transwell細胞侵襲實驗顯示對照組每100倍視野下平均穿過19.9±3.7個細胞，25μg/ml PMPs組穿過39.2

6、±6.9個細胞，50μg/ml PMPs組穿過80.4±9.4個細胞，實驗組與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4、PMPs促進RA-FLS與三種ECM模擬物（Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel）發(fā)生黏附，25μg/ml PMPs組細胞對Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel的黏附率分別為對照組的1.08±0.09倍、1.17±0.10倍和1.08±0.10倍，其中人纖維連接蛋白有統(tǒng)計學(xué)意義。50μg/ml PMPs組細胞對

7、Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel的黏附率分別為對照組的1.25±0.12倍、1.31±0.13倍和1.19±0.12倍，三種ECM模擬物均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、高通量基因芯片檢測顯示PMPs能夠影響RA-FLS多種基因的表達，富集分析結(jié)果顯示差異性表達的基因主要集中于ECM受體相互作用、局部黏附、細胞黏附分子、MAPK信號通路相關(guān)的多種基因?；蛐酒Y(jié)果顯示PMPs組中MMP1的表達量高于對照組。隨后的RT-qPCR結(jié)

8、果證實25μg/ml PMPs組中MMP1表達量高于對照組，而MMP2的表達不存在明顯差異。
　　6、Western blot結(jié)果顯示25μg/ml PMPs組相較于對照組，MMP1表達量，p-ⅠκB水平，p-NF-κ B水平和p-Erk水平均上調(diào)。50μg/ml PMPs組中MMP1，p-Ⅰκ B水平，p-NF-κ B水平和p-Erk水平表達量的上調(diào)更為明顯。而MMP2和p-Akt水平在各組間變化不明顯。
　　結(jié)論: