先天性小耳畸形長鏈非編碼RNA和信使RNA的差異表達分析及調(diào)控關系的研究.pdf

1、目的:通過對先天性小耳畸形患者的殘耳軟骨與對側正常耳廓軟骨組織進行基因芯片的檢測，篩選出小耳畸形相關差異表達的LncRNAs和mRNAs，根據(jù)生物信息學分析KEGG通路、GO分析等方法對差異表達的mRNAs進行功能注釋和分析。進一步篩選出可能與小耳畸形相關的LncRNAs和mRNAs，并通過qRT-PCR和Western blotting的方法進一步進行驗證，為今后深入研究先天性小耳畸形的分子機制及其防治提供科學依據(jù)。
　　方法:

2、樣本均源于中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院收治的單側非綜合征型先天性小耳畸形患者?；级罢６M織均無感染及軟骨炎等征象。樣本均來源于耳再造三期手術中的廢棄組織，每側各約100mg,其中正常側耳廓軟骨組織取自術中為矯正雙側顱耳角不對稱所廢棄的部分。本實驗以殘耳軟骨組織為實驗組，正常耳軟骨組織為對照組。
　　通過Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0篩選單側先天性小耳畸形患者差異表達的LncRNAs和

3、mRNAs。通過KEGG生物學通路分析、GO分析等對差異表達的LncRNAs和mRNAs進行功能注釋和預測，并采用CNC共表達網(wǎng)絡關系圖對重點的LncRNAs進行編碼-非編碼基因共表達網(wǎng)絡的構建。根據(jù)生物信息學分析選擇LncRNA-NR_028308、LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及其鄰近編碼蛋白基因Zinc Finger Protein36-Like2(ZF

4、P36L2)兩組基因，通過實時定量聚合酶鏈反應和Western blotting的方法進一步驗證其表達情況。
　　結果:本實驗所用的基因芯片包含30586個lncRNAs和26109個mRNAs探針;與正常側軟骨比較，殘耳軟骨共檢測出差異性表達LncRNAs共有180條，其中表達上調(diào)的LncRNAs有74條，表達下調(diào)的LncRNAs有106條。差異表達的mRNAs共有515條，其中表達上調(diào)的mRNAs有101條，表達下調(diào)的mRNA

5、s有414條。信號通路分析顯示上調(diào)通路有5條，下調(diào)通路有27條，涉及到甘油酯類代謝、破骨細胞分化、腫瘤生長等通路。在GO分析中，我們的結果中上調(diào)基因中涉及生物過程的基因有321條，涉及細胞組件的基因有16條，以及分子功能的基因有41條。下調(diào)基因中涉及生物過程的基因共有553條，涉及細胞組件的基因有101條，以及分子功能的基因有74條。同時選擇了15個LncRNAs和120個mRNAs構建了CNC共表達網(wǎng)絡。
　　我們對所選擇的Ln

6、cRNA-NR_028308、LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及ZFP36L2兩組基因，通過實時定量聚合酶鏈反應和Western blotting的方法進一步驗證其表達情況。與對照組驗證結果顯示，qRT-PCR方法驗證的兩組LncRNAs和mRNAs基因表達均上調(diào)，P值小于0.05，與芯片結果一致。用Western blotting法檢測差異表達基因蛋白水平的表

7、達，結果顯示與對照組相比，實驗組軟骨組織中與對照組相比LPL、TNFRSF11B和ZFP36L2基因表達上調(diào)。
　　結論:先天性小耳畸形在相同遺傳背景下殘耳軟骨與正常耳廓軟骨組織之間lncRNAs和mRNAs的表達存在明顯的差異，這些lncRNAs及mRNAs可能通過某些信號通路在小耳畸形發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。LncRNA-NR_028308、LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENS