先天性小耳畸形候選致病基因篩選和畸形耳組織中microRNA表達(dá)譜的研究.pdf

1、第一部分先天性小耳畸形候選致病基因的篩選和驗(yàn)證
　　目的:(1)應(yīng)用Affymetrix SNP6.0芯片和直接測(cè)序驗(yàn)證相結(jié)合的方法，篩選先天性小耳畸形的候選致病基因。
　　(2)檢測(cè)中國(guó)Treacher Collins綜合征患者TCOF1基因的突變情況。
　　方法:(1)收集先天性小耳畸形患者112例，對(duì)其中的3例患者血液基因組進(jìn)行Affymetrix SNP6.0芯片分析獲得候選致病基因，然后在112例患者中對(duì)候選

2、基因的外顯子直接測(cè)序驗(yàn)證。
　　(2)采用直接測(cè)序的方法對(duì)3例Treacher Collins綜合征患者血液基因組中TCOF1所有外顯子，外顯子內(nèi)含子交界區(qū)和5'端上游1200bp進(jìn)行突變分析。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)的分析篩選出5個(gè)候選致病基因MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PACT。
　　(2)在112例患者中檢測(cè)了GSC，HOXA2和PACT的外顯子序列，檢測(cè)出3個(gè)多態(tài)性改變和位于HOXA2的5'

3、非翻譯區(qū)的新發(fā)改變90G＞GA和114A＞AC，未發(fā)現(xiàn)致病突變。
　　(3)在3個(gè)Treacher Collins綜合征患者鑒定出12個(gè)TCOF1基因序列改變，包含4個(gè)新發(fā)的多態(tài)性改變-26T＞A，17693G＞A，21761-21765delCTCTC和21968G＞T。
　　結(jié)論:(1)GSC，HOXA2和PACT不是先天性小耳畸形的熱點(diǎn)突變基因。位于HOXA2的5'非翻譯區(qū)的新發(fā)改變的功能有待進(jìn)一步研究。
　　(

4、2)未在3例TCS患者血液基因組中發(fā)現(xiàn)TCOF1基因的致病突變，Treacher Collins綜合征患者可能存在其他致病基因或致病因素。
　　第二部分畸形患耳組織中microRNA表達(dá)譜的研究
　　目的:通過(guò)研究先天性小耳畸形患耳組織中microRNA異常表達(dá)情況，探討其在先天性小耳畸形發(fā)生過(guò)程中的作用，為今后基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:收集先天性小耳畸形患耳組織19例和正常耳廓組織5例，選取4例患耳組織和2例

5、正常組織，抽取總RNA，采用北京博奧公司的AffymetrixmiRNA芯片檢測(cè)microRNA表達(dá)情況，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果驗(yàn)證，挑選出表達(dá)有顯著差異的microRNA預(yù)測(cè)靶基因。
　　結(jié)果:(1)芯片篩查出表達(dá)上調(diào)的microRNA有7個(gè)，分別是hsa-miR-16，hsa-miR-140-3p,hsa-miR-126,hsa-miR-185,hsa-miR-378, hsa-miR-451和hsa-miR-486

6、-5p，表達(dá)下調(diào)的microRNA有5個(gè)，分別是hsa-miR-203，hsa-miR-205, hsa-miR-200c, hsa-miR-708和hsa-miR-1308。
　　(2)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符，差異有顯著性的表達(dá)上調(diào)microRNA有hsa-miR-126和hsa-miR-451，差異有顯著性的表達(dá)下調(diào)microRNA有hsa-miR-203, hsa-miR-205和hsa-miR-200c。

7、
　　(3)靶基因預(yù)測(cè):hsa-miR-126的靶基因篩選后得到26個(gè)，hsa-miR-451的靶基因篩選后得到15個(gè)，其中有很多基因的功能是未知的。
　　結(jié)論:建立了先天性小耳畸形microRNA表達(dá)譜，初步篩查出7個(gè)表達(dá)上調(diào)和5個(gè)表達(dá)下調(diào)的microRNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證得到了5個(gè)表達(dá)差異有顯著性的microRNA，證明芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠。靶基因中有些基因的功能尚未有報(bào)道，本研究將挑選其中的基因繼續(xù)進(jìn)行動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)