人源化AGR2單抗的瞬時(shí)表達(dá)及初步成藥性評(píng)價(jià).pdf

1、Anterior gradient-2（AGR2）是從乳腺癌細(xì)胞MCF-7的cDNA文庫(kù)中篩選出的非洲爪蟾XAG2（Xenopus anterior gradient-2）的同源基因，在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)及耐藥性等方面有重要作用。rhAGR2-mAb是以 AGR2為靶標(biāo)的人源化單克隆抗體，rhAGR2-mAb單抗通過(guò)結(jié)合 AGR2蛋白分子上獨(dú)特的不連續(xù)位點(diǎn)從而阻斷 AGR2的功能，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移的目的。本研究通過(guò)瞬時(shí)

2、轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞表達(dá)rhAGR2-mAb并純化獲得重組蛋白抗體，比較HEK293F細(xì)胞與CHO細(xì)胞表達(dá)的rhAGR2-mAb在分子量、等電點(diǎn)、親和力和糖基化等方面的異同，以及進(jìn)行 rhAGR2-mAb急性毒性實(shí)驗(yàn)與藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)初步成藥性評(píng)價(jià)，為rhAGR2-mAb的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究采用聚乙烯亞胺介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞表達(dá)rhAGR2-mAb，通過(guò)正交試驗(yàn)得出在5mL體系中HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)

3、rhAGR2-mAb的最佳條件是：細(xì)胞密度為6×106cells/mL，DNA濃度為0.5μg/106 cells，DNA:PEI為1:4，LC％為50%。且以此條件線性放大到30mL、100mL培養(yǎng)體積中，蛋白產(chǎn)量無(wú)明顯損失，但在350mL培養(yǎng)體積時(shí)表達(dá)量有一定下降。細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)Protein A親和層析柱一步純化可得純度達(dá)95%以上，純化產(chǎn)物對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖有較明顯的抑制作用。比較HEK293F細(xì)胞與CHO細(xì)胞表達(dá)的rhAGR

4、2-mAb發(fā)現(xiàn)，不同宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體蛋白在分子量、等電點(diǎn)、糖型種類方面無(wú)明顯差異，但兩者親和力和糖型的比例有較大差異。
　　本研究設(shè)置小鼠急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行100mg/kg rhAGR2-mAb腹腔給藥，從軀體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、皮膚和被毛、黏膜、眼等指標(biāo)觀察動(dòng)物反應(yīng)，并通過(guò)HE切片染色觀察其對(duì)心、肝、脾、肺、腎等主要器官的影響，給藥后1周內(nèi)，均未見(jiàn)明顯異常，且小鼠體重與溶劑對(duì)照組相比沒(méi)有顯

5、著性差異。即 rhAGR2-mAb對(duì)小鼠的急性毒性最小致死劑量（MLD）大于100mg/kg。此外，本研究進(jìn)行了rhAGR2-mAb的大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究，建立了ELISA的方法檢測(cè)大鼠血清中rhAGR2-mAb的含量，在檢測(cè)范圍、靈敏度、回收率、特異性、精密度以及準(zhǔn)確度上均滿足動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。對(duì)大鼠進(jìn)行5.6mg/kg腹腔給藥，檢測(cè)大鼠的血藥濃度得出rhAGR2-mAb的半衰期約為11天，AUC0-∞為（30001.95±99