魚(yú)精蛋白模擬肽成藥性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：魚(yú)精蛋白（Protamine；通用名：硫酸魚(yú)精蛋白，Protamine sulfate，PS）是從鮭魚(yú)，鯡魚(yú)或其他魚(yú)類(lèi)精子中提取出的強(qiáng)陽(yáng)離子，富含精氨酸的混合蛋白。PS具有強(qiáng)大的正電性，可以和負(fù)電性的肝素緊密結(jié)合，使肝素失去抗凝作用，所以在臨床上，PS作為肝素中和劑被廣泛使用；同時(shí)PS還可以與胰島素合用，增長(zhǎng)胰島素的吸收時(shí)間，繼而被廣泛的應(yīng)用于糖尿病的治療。雖然PS擁有良好的藥效，但是也具有很多副作用：因?yàn)镻S是一種強(qiáng)堿性的混合蛋

2、白，用藥后會(huì)引起體循環(huán)血壓降低，過(guò)敏及類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)和災(zāi)難性肺動(dòng)脈高壓等；PS是用硫酸從魚(yú)類(lèi)精子中提取的分子量不均一的雜蛋白。不同種類(lèi)的魚(yú)類(lèi)，或者相同種類(lèi)不同產(chǎn)地的魚(yú)類(lèi)都會(huì)極大地影響PS的產(chǎn)品質(zhì)量，使PS難以建立嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。而且，PS是目前FDA和CFDA唯一批準(zhǔn)的臨床拮抗肝素的藥物，2011年還一度成為孤兒藥，出現(xiàn)一藥難求的狀況。因此研制出一種成分均一，分子量明確的高效低毒的肝素拮抗新藥是很有必要的。實(shí)驗(yàn)室前期根據(jù)PS富含精氨酸的特性

3、，設(shè)計(jì)了一系列不同精氨酸個(gè)數(shù)的小肽，并篩選出一個(gè)具有高活性的15個(gè)精氨酸的小肽（命名為R15）。這個(gè)小肽劑量藥效關(guān)系明確，組成單一，批次間不會(huì)有較大差異，可以建立明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于商業(yè)化生產(chǎn)。本文對(duì)R15的硫酸鹽（命名為R15S）進(jìn)行了體內(nèi)外成藥性系列實(shí)驗(yàn)，在肝素中和活性，藥物安全性，免疫反應(yīng)性方面與PS進(jìn)行了比較和研究。
　　方法：本研究通過(guò)硫酸乙醇溶液制備R15的硫酸鹽，R15S。利用高效液相色譜儀（High perfor

4、mance liquid chromatograph，HPLC）對(duì)R15S的水溶液進(jìn)行30天室溫穩(wěn)定性的檢測(cè)；在藥效方面，本研究利用中國(guó)藥典中硫酸魚(yú)精蛋白效價(jià)檢測(cè)法對(duì)PS，R15和R15S進(jìn)行了效價(jià)的檢測(cè)。通過(guò)APTT，anti-Xa和anti-IIa的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)比PS和R15S的抗肝素活性；在R15S的安全性評(píng)價(jià)方面，本研究利用MTT實(shí)驗(yàn)和小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)得到R15S的細(xì)胞毒水平和半數(shù)致死量。在肝素化的Wistar大鼠中，分別快速

5、靜脈注射R15S和PS，使用生理儀監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓的變化程度，研究?jī)蓚€(gè)肝素拮抗劑在快速靜脈推注后血壓的變化；在免疫學(xué)方面，本研究使用R15S和PS對(duì)雌性豚鼠進(jìn)行了免疫和抗體檢測(cè)，比較R15S和PS的免疫原性。為了研究胰島素患者的用藥風(fēng)險(xiǎn)，本研究利用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)R15S和豚鼠抗PS抗體的交叉反應(yīng)程度。
　　結(jié)果：本研究制備了R15的硫酸鹽R15S。研究表明R15S水溶液在室溫下（25±3℃）30天穩(wěn)定；在肝素中和活性方面，AP

6、TT實(shí)驗(yàn)，anti-Xa實(shí)驗(yàn)和anti-IIa體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R15S與PS的抗肝素能力相似；體內(nèi)外安全性評(píng)價(jià)研究表明，R15S在60μg·mg-1的濃度下無(wú)細(xì)胞毒性，與PS相似，但在高濃度時(shí)R15S的毒性更低（250μg·mg-1~1000μg·mg-1）。PS靜脈推注昆明小鼠，測(cè)得的半數(shù)致死量為35.4 mg·kg-1，與PS相當(dāng)（LD50（PS，i.v.）=30 mg·kg-1~38 mg·kg-1）。肝素化Wistar大鼠在快

7、速靜脈注射R15S和PS后平均動(dòng)脈壓均下降22 mmHg左右，即PS和R15S在快速靜脈推注后均會(huì)引起平均動(dòng)脈壓的下降；在免疫反應(yīng)性的考察中，PS組8/10只豚鼠產(chǎn)生了PS抗體（滴度1:1000），R15S組沒(méi)有一只豚鼠產(chǎn)生抗體，所以R15S對(duì)豚鼠沒(méi)有免疫原性。R15S和豚鼠的抗PS抗體的交叉反應(yīng)程度約為30％，低于PS的80%的交叉反應(yīng)。綜上所述，R15S的藥效和安全性方面（細(xì)胞毒性，急性毒性，快速靜脈推注對(duì)血壓的影響）與PS相似，但