燒傷后高遷移率族蛋白B1對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的： 實(shí)驗(yàn)一：(1)采用嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇動物模型，明確高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的變化及其與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)免疫功能的關(guān)系。(2)通過嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇動物模型，闡明HMGB1對Treg分化成熟的受體作用機(jī)制。(3)探討嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇后HMGB1介導(dǎo)的Treg對樹突狀細(xì)胞(DC)免疫功能的影響及調(diào)節(jié)作用。(4)探討嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇后HMGB1介導(dǎo)的Treg對T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及調(diào)節(jié)途徑。(5)觀察丙酮酸乙酯

2、(EP)對重度燙傷延遲復(fù)蘇動物免疫功能及臟器損害的可能保護(hù)效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)二：(1)對臨床嚴(yán)重?zé)齻颊哌M(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，明確嚴(yán)重?zé)齻蟛∪送庵苎狧MGB1、Treg分化成熟以及T淋巴細(xì)胞免疫功能的變化規(guī)律，探討HMGB1、Treg及T淋巴細(xì)胞免疫功能改變在患者燒傷后發(fā)生膿毒癥及不良預(yù)后中所起的作用及臨床意義。(2)探討嚴(yán)重?zé)齻驢MGB1、Treg及T淋巴細(xì)胞免疫指標(biāo)間的相互關(guān)系及可能的作用機(jī)制。 方法： 1.采用重度燙

3、傷延遲復(fù)蘇動物模型，即雄性清潔級Wistar大鼠，浸于沸水中造成30％體表面積Ⅲ度燙傷。傷后延遲6小時(shí)抗休克復(fù)蘇，在傷后6小時(shí)從腹腔給予林格液(40 ml/kg)抗休克治療，此外在燙傷后12、24、36、48小時(shí)分別給予4 ml/次林格液腹腔內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)分組：136只大鼠隨機(jī)分為5組，(1)正常對照組(n=8)：麻醉后活殺；(2)假燙傷組(n=32)；(3)燙傷組(n=32)；(4)EP治療組(n=32)：EP加入林格液中隨補(bǔ)液給藥(E

4、P為28 mM)；(5)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)抗體(1 mg/ml)治療組(n=32)：燙傷后6、24小時(shí)從陰莖背靜脈給予RAGE抗體(1 mg/kg)治療。以上后4組實(shí)驗(yàn)動物再分為4個(gè)亞組，分別于燙傷后1、3、5、7天處死動物，無菌留取血和脾臟標(biāo)本。分離血清，-20℃貯存。脾臟一部分無菌、無酶液氮凍存，另一部分用于提取Treg、DC和T淋巴細(xì)胞。Treg、DC的分離純化采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)進(jìn)行。利用B細(xì)胞和

5、單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，分離T淋巴細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞免疫表型和細(xì)胞表面受體，MTT法檢測脾T淋巴細(xì)胞增殖，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清、細(xì)胞孵育上清及組織勻漿液的細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞活化的核因子(NF)-κB。采用熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平。 2.對106例燒傷總面積大于或等于30％的患者進(jìn)行動態(tài)觀察，對所采集臨床病歷資料進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)分組：(1)按燒傷總面積將患者分為三組：Ⅰ組41例

6、(燒傷總面積30％～49％)，Ⅱ組34例(燒傷總面積50％～69％)，Ⅲ組31例(燒傷總面積70％～99％)；(2)根據(jù)燒傷膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者進(jìn)一步分為膿毒癥組(59例)與非膿毒癥組(47例)；(3)根據(jù)膿毒癥患者的預(yù)后情況，將其分為死亡組(17例)與存活組(42例)。同時(shí)設(shè)正常對照組(25位健康獻(xiàn)血員)。分別于燒傷后1、3、7、14、21天采集患者外周靜脈血，分離外周血T淋巴細(xì)胞，采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)對外周血Tr

7、eg進(jìn)行分離純化，同時(shí)分離血清，-20℃貯存。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞免疫表型，MTT法檢測T淋巴細(xì)胞增殖活性，ELISA檢測血清HMGB1及細(xì)胞孵育上清的細(xì)胞因子水平，采用熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平。 結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)一：(1)HMGB1在嚴(yán)重燙傷后具有升高較晚、持續(xù)時(shí)間較長的特征。HMGB1可能參與了燙傷后膿毒癥所致多器官損害的發(fā)病過程。(2)HMGB1的持續(xù)升高可刺激Treg向成熟發(fā)展，從而介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

8、低下，并向Th2漂移，免疫功能抑制。(3)燙傷后大量的HMGB1可能主要通過受體RAGE介導(dǎo)Treg表型表達(dá)、Treg功能成熟。(4)HMGB1介導(dǎo)的Treg功能成熟可影響燙傷后DC細(xì)胞向成熟發(fā)育，但其表型表達(dá)異常，功能出現(xiàn)障礙。(5)HMGB1介導(dǎo)的Treg功能成熟還可通過下調(diào)T淋巴細(xì)胞NF-κB活性而減少了IL-2基因表達(dá)和蛋白合成，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)和免疫功能。(6)EP可能主要通過抑制HMGB1的合成釋放，改善燙傷延遲

9、復(fù)蘇動物細(xì)胞免疫功能紊亂，保護(hù)動物的主要臟器功能。 實(shí)驗(yàn)二：(1)HMGB1在嚴(yán)重?zé)齻缶哂性龈咻^晚、持續(xù)時(shí)間較長的特征，其含量與燒傷嚴(yán)重程度、并發(fā)膿毒癥及患者預(yù)后相關(guān)，HMGB1參與了嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體免疫紊亂、發(fā)生膿毒癥并致患者死亡的病理過程。(2)嚴(yán)重?zé)齻骉reg功能向成熟發(fā)展，使其免疫抑制功能充分發(fā)揮，從而可能導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能紊亂。其表面分子表達(dá)及細(xì)胞因子分泌在不同燒傷面積、是否并發(fā)膿毒癥及是否存活等不同組間存在顯著差異

10、，Treg可通過分泌抑制性細(xì)胞因子參與了嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體免疫失衡、誘發(fā)膿毒癥甚至最終造成患者死亡的病理過程。(3)嚴(yán)重?zé)齻骉淋巴細(xì)胞免疫功能受到抑制，并引起T淋巴細(xì)胞向Th2漂移。燒傷程度越重、膿毒癥發(fā)生率和患者死亡率越高，機(jī)體免疫抑制狀態(tài)也越明顯。(4)HMGB1含量與Treg及T淋巴細(xì)胞相關(guān)免疫指標(biāo)均無明顯相關(guān)，而Treg免疫指標(biāo)與T淋巴細(xì)胞免疫功能指標(biāo)間存在顯著相關(guān)性(正相關(guān)或負(fù)相關(guān)).說明Treg可能對嚴(yán)重?zé)齻骉淋巴細(xì)胞免疫功