男性生殖細胞發(fā)育相關七個轉(zhuǎn)錄因子電轉(zhuǎn)染HuMSCs后的表達與調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　精子發(fā)生是指在睪丸曲細精管中的初級生殖細胞發(fā)育為成熟精子的過程，其起始于精原干細胞（SSCs）的增殖和分化，是一個循環(huán)有序、高度協(xié)調(diào)、持續(xù)進行的過程，這個過程受到各種內(nèi)外源性因子的嚴格調(diào)控，其中組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要作用。相關研究表明，TAF4B、LHX1、FOXO1、ETV5、ID4、PLZF、BCL6B是精原干細胞發(fā)育和功能維持的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，而SOX17及其下游基因BLIMP1亦已被證實對調(diào)控早期生殖細

2、胞發(fā)育至關重要。我們的前期工作以慢病毒作為載體將OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28等六個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入人臍帶間充質(zhì)干細胞(HuMSCs)中，成功構(gòu)建了具有很強生殖分化潛能的HuMSCs來源的誘導性多能干細胞（iPSCs），并發(fā)現(xiàn)HuMSCs源iPSCs經(jīng)BMP4向男性生殖細胞方向誘導分化過程中TAF4B等七個組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子規(guī)律性表達，提示它們可能介導了SSCs不同階段的發(fā)育。本研究希望借助HuMSC

3、s、HuMSCs源iPSCs和電轉(zhuǎn)染技術，進一步梳理TAF4B、LHX1、FOXO1、ETV5、ID4、PLZF、BCL6B這七個精子發(fā)生關鍵轉(zhuǎn)錄因子間可能存在的調(diào)控網(wǎng)絡，并探究SOX17及其下游基因BLIMP1與TAF4B等七個轉(zhuǎn)錄因子在男性生殖細胞誘導分化過程中的調(diào)控關系，以期發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生相關基因新的調(diào)節(jié)通路，進一步理解精子發(fā)生這一復雜過程，為今后通過組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子直接轉(zhuǎn)分化獲得不育患者自身來源的生殖細胞，治療男性不育，提供

4、新的思路。
　　方法：
　?、沤M織塊貼壁法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，消化傳代至第3代后將重組質(zhì)粒TAF4B、LHX1、FOXO1、ETV5、ID4、PLZF、BCL6B分別通過共同和單獨兩種方式電轉(zhuǎn)染入HuMSCs中，電轉(zhuǎn)后48h進行藥物篩選，取藥篩后12d細胞標本，以未加入質(zhì)粒直接進行電轉(zhuǎn)染操作的第3代HuMSCs中TAF4B等七個轉(zhuǎn)錄因子及SOX17、BLIMP1基因表達量為基礎表達量，利用Real-time qPCR技術

5、檢測共同電轉(zhuǎn)染和分別單獨電轉(zhuǎn)染TAF4B等七個質(zhì)粒后各轉(zhuǎn)錄因子及SOX17、BLIMP1基因表達量的變化。⑵HuMSCs源iPSCs在體外經(jīng)擬胚體方式由骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）向男性生殖細胞方向誘導分化，選取誘導后不同時間點（誘導當天、第3天、第7天、第10天、第14天，第21天）檢測SOX17和BLIMP1基因的表達變化。
　　結(jié)果：
　　①將TAF4B、LHX1、FOXO1、ETV5、ID4、PLZF、BCL6B七個

6、轉(zhuǎn)錄因子共同電轉(zhuǎn)染入第3代HuMSCs后TAF4B等七個轉(zhuǎn)錄因子及SOX17基因表達量均有不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計學意義，其中PLZF、SOX17表達上調(diào)尤為明顯，結(jié)果表明TAF4B等七個質(zhì)粒可成功電轉(zhuǎn)染入第3代HuMSCs并使各組織細胞特異轉(zhuǎn)錄因子及SOX17基因表達上調(diào)；進一步將TAF4B等七個質(zhì)粒進行分別單獨電轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示單獨電轉(zhuǎn)染TAF4B質(zhì)粒后， TAF4B、FOXO1、ID4、BCL6B表達升高，ETV5、PLZF表達

7、下降；單獨電轉(zhuǎn)染LHX1質(zhì)粒后，LHX1、TAF4B、FOXO1、ETV5、ID4、BCL6B表達升高，PLZF表達下降；單獨電轉(zhuǎn)染FOXO1質(zhì)粒后，F(xiàn)OXO1、TAF4B、ETV5、ID4、BCL6B表達升高，LHX1、PLZF表達下降；單獨電轉(zhuǎn)染ETV5質(zhì)粒后，TAF4B、FOXO1、ETV5、ID4、BCL6B表達升高；單獨電轉(zhuǎn)染ID4質(zhì)粒后，TAF4B、FOXO1、ID4、PLZF、BCL6B表達升高，ETV5表達下降；電轉(zhuǎn)染P

8、LZF質(zhì)粒后，TAF4B、FOXO1、ETV5、ID4、BCL6B表達升高，PLZF表達下降；單獨電轉(zhuǎn)染BCL6B質(zhì)粒后，TAF4B、FOXO1、ETV5、ID4、BCL6B表達升高；差異均具有統(tǒng)計學意義；單獨電轉(zhuǎn)染TAF4B、LHX1、FOXO1、ETV5、ID4、PLZF、BCL6B均能使SOX17表達明顯升高；單獨電轉(zhuǎn)染LHX1、PLZF后BLIMP1表達輕微升高，電轉(zhuǎn)染TAF4B、BCL6B后BLIMP1表達下降，差異均具有統(tǒng)計

9、學意義。②在HuMSCs源iPSCs在體外經(jīng)擬胚體方式由BMP4向男性生殖細胞方向誘導分化過程的不同時間點，SOX17及其下游基因BLIMP1表達量規(guī)律升高及下降，呈規(guī)律性表達，其中SOX17表達在誘導后第3天開始升高達到最高值，第7天升高幅度下降，至第10天為表達上升的最低值，表達升高持續(xù)至誘導后第14天，在誘導后第21天表達量較自發(fā)分化組下降，差異均具有統(tǒng)計學意義；而BLIMP1基因表達亦在誘導后第3天開始升高并達到最高值，至誘導后

10、第7天輕微上調(diào)，到第10天上調(diào)幅度上升，表達升高持續(xù)至誘導后第14天，在誘導后第21天表達下降，差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　?、臫AF4B、LHX1、FOXO1、ETV5、ID4、PLZF、BCL6B七個組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子相互間存在著復雜的調(diào)控關系，它們所構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡貫穿了精原干細胞發(fā)育和功能維持的每個環(huán)節(jié)，共同介導了精子發(fā)生的順利進行。⑵SOX17及其下游基因BLIMP1在HuMSCs源iPSCs經(jīng)BMP4