組織工程化人視網膜色素上皮復合體的研究.pdf

1、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）是位于神經視網膜與Bruch膜之間的單層細胞，具有吞噬感光細胞外節(jié)、分泌營養(yǎng)因子、參與視循環(huán)代謝和形成血一視網膜屏障等功能，對于維持視網膜正常生理功能十分重要。視網膜色素上皮細胞功能受損將導致包括老年性黃斑變性、視網膜色素變性、Stargardt's綜合征等致盲性疾病。目前這類疾病尚缺乏有效治療措施，RPE移植有望替代患者受損的RPE，從而保護感光細胞，是目前

2、最有前景的治療措施。
　　RPE種子細胞的來源是制約RPE移植臨床轉化的重要因素。胚胎干細胞(embryonicstem cell，ESC)具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力，同時細胞性狀穩(wěn)定，可用于大規(guī)模標準化生產RPE細胞，十分適合于臨床應用。目前，ESC經自然分化法誘導而來的RPE細胞(SD-RPE)已進入臨床試驗階段。三維培養(yǎng)是一種全新的ESC誘導分化技術，已有研究在體外將ESC三維培養(yǎng)分化為視杯樣結構，該方法較好地模

3、擬了視網膜的體內發(fā)育過程，有望獲得更接近于體內正常RPE的種子細胞。
　　RPE細胞的移植方式也影響著其在體內的存活與功能發(fā)揮。目前主要包括兩種移植方式:細胞懸液移植及細胞片移植。雖然細胞懸液移植手術操作較簡單，但植入的種子細胞有聚集成團，難以形成有極性單層細胞的問題，不利于RPE細胞在視網膜內的功能發(fā)揮。細胞片移植可維持RPE種子細胞在視網膜內的單層、極性結構，有望提高RPE移植后的效果。組織工程化RPE復合體是將RPE細胞體外

4、培養(yǎng)在生物材料上，形成有極性的、有功能的單層RPE細胞片后，再將生物材料與RPE細胞片的復合物移植到視網膜下腔。如今已有多種生物材料被用于構建組織工程化RPE復合體，來模擬RPE-Bruch膜復合體，但理想的生物材料需同時兼顧生物相容性、可降解性、手術可操作性以及適合RPE細胞的貼壁、生長等因素。
　　目的:
　　研究ESC經三維培養(yǎng)分化而來的RPE細胞(3D-RPE)的生物學特性，獲得最優(yōu)的RPE種子細胞;探討生物材料對于

5、RPE細胞的生物相容性，制備具有良好生物相容性的生物材料，并模擬RPE-Bruch膜復合體構建組織工程化RPE，研究該復合體生物學特性以及移植后對于視網膜變性的挽救作用。
　　方法與結果:
　　本研究分為三個部分:
　　第一部分:人胚胎干細胞經三維培養(yǎng)法誘導的視網膜色素上皮細胞的細胞生物學特性研究
　　1、研究3D-RPE細胞在分化不同時間點的細胞形態(tài)、超微結構和增殖能力，發(fā)現3D-RPE細胞具有類似于體內正常R

6、PE細胞的鋪路石樣形態(tài)。細胞頂端出現了大量的微絨毛，色素顆粒主要集中在細胞質上方，細胞核位于細胞質下方，細胞膜的頂端和底端都出現了窖蛋白，細胞之間形成了緊密連接和縫隙連接，粘附連接和橋粒。與分化同一時間點的SD-RPE細胞相比，3D-RPE細胞的增殖能力更強。
　　2、研究3D-RPE細胞在分化不同時間點的基因表達譜，發(fā)現3D-RPE細胞在分化至40d時全基因組表達譜最接近于人胚胎RPE;隨著分化時間的延長，3D-RPE細胞的與分

7、化成熟相關的基因將逐漸上調，但均低于同一時間點的SD-RPE細胞基因表達水平。
　　3、研究3D-RPE細胞在分化不同時間點的吞噬功能、極性、分泌營養(yǎng)因子功能、緊密連接和縫隙連接，發(fā)現3D-RPE細胞比同一時間點的SD-RPE細胞形成了更強的細胞間緊密連接，更早形成了細胞極性，但吞噬感光細胞外節(jié)和分泌營養(yǎng)因子的功能不如同一分化時間點的SD-RPE細胞。
　　第二部分:基于不可降解聚酯薄膜(PET)構建的組織工程化人視網膜色素

8、上皮復合體的研究
　　1、研究3D-RPE細胞在PET膜上的生長特性，發(fā)現PET/RPE復合體形成了有極性的單層細胞，能夠吞噬感光細胞外節(jié)、分泌營養(yǎng)因子、形成了緊密連接。
　　2、研究基于PET膜的3D-RPE細胞片移植到RCS大鼠視網膜下腔后對視功能的影響，發(fā)現PET/RPE復合體能夠延緩RCS大鼠的視網膜變性，與RPE細胞懸液無顯著差異，并且PET/RPE復合體移植引起了較嚴重的炎癥反應。
　　第三部分:基于可降解

9、的石墨烯膜構建的組織工程化人視網膜色素上皮復合體的研究
　　1、研究不同修飾的石墨烯納米顆粒對于眼細胞的毒性，將不同化學修飾、不同表面電荷和不同氧化程度的石墨烯納米顆粒與四種眼細胞（ESC-RPE細胞，人結膜上皮細胞，人角膜上皮細胞，人血管內皮細胞）共培養(yǎng)后檢測石墨烯納米顆粒對于眼細胞的活力、凋亡、氧化應激和線粒體膜電位的影響，發(fā)現聚乙二醇(PEG)修飾能夠顯著改善氧化石墨烯(GO)的生物相容性;不同表面電荷的石墨烯納米顆粒對于眼

10、細胞的活力、凋亡、氧化應激和線粒體膜電位無顯著差異;石墨烯的氧化程度與眼細胞的活力呈負相關，與眼細胞的氧化應激反應呈正相關。
　　2、研究3D-RPE細胞在PEG修飾后低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)膜上的生長特性，發(fā)現PEG-GO-S/RPE復合體能夠分泌營養(yǎng)因子并且形成了緊密連接。
　　3、研究基于PEG-GO-S膜的3D-RPE細胞片移植到RCS大鼠視網膜下腔后的生物相容性，發(fā)現PEG-GO-S/RPE復合體

11、移植并沒有引起嚴重的炎癥反應。
　　結論:
　　1、3D-RPE細胞具有類似于體內RPE細胞的形態(tài)、超微結構、極性和全基因組表達譜，并具有吞噬、分泌營養(yǎng)因子、形成緊密連接和縫隙連接的功能，是一種新的RPE種子細胞。
　　2、3D-RPE細胞隨著在體外分化時間延長逐漸成熟，色素加深、增殖能力減弱、細胞極性形成，吞噬功能、營養(yǎng)因子分泌和細胞之間緊密連接等功能逐漸增強;與同一分化時間點的SD-RPE細胞相比，3D-RPE細胞

12、成熟更慢。
　　3、PET膜可用于構建有極性、有功能的單層RPE復合體，PET/RPE復合體移植后可延緩RCS大鼠視網膜變性，但同時也會引起較嚴重的炎癥反應。
　　4、石墨烯的表面化學修飾和氧化程度是決定其對眼細胞產生生物毒性的主要原因，表面電荷對于其生物毒性無顯著影響;PEG修飾后的低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)對眼細胞的生物毒性最低，PEG-GO-S膜可用于構建有功能的單層RPE細胞片，PEG-GO-S/RP