組織工程化人視網(wǎng)膜色素上皮復(fù)合體的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）是位于神經(jīng)視網(wǎng)膜與Bruch膜之間的單層細(xì)胞，具有吞噬感光細(xì)胞外節(jié)、分泌營(yíng)養(yǎng)因子、參與視循環(huán)代謝和形成血一視網(wǎng)膜屏障等功能，對(duì)于維持視網(wǎng)膜正常生理功能十分重要。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能受損將導(dǎo)致包括老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、Stargardt's綜合征等致盲性疾病。目前這類疾病尚缺乏有效治療措施，RPE移植有望替代患者受損的RPE，從而保護(hù)感光細(xì)胞，是目前

2、最有前景的治療措施。
　　RPE種子細(xì)胞的來(lái)源是制約RPE移植臨床轉(zhuǎn)化的重要因素。胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cell，ESC)具有無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的能力，同時(shí)細(xì)胞性狀穩(wěn)定，可用于大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)RPE細(xì)胞，十分適合于臨床應(yīng)用。目前，ESC經(jīng)自然分化法誘導(dǎo)而來(lái)的RPE細(xì)胞(SD-RPE)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。三維培養(yǎng)是一種全新的ESC誘導(dǎo)分化技術(shù)，已有研究在體外將ESC三維培養(yǎng)分化為視杯樣結(jié)構(gòu)，該方法較好地模

3、擬了視網(wǎng)膜的體內(nèi)發(fā)育過(guò)程，有望獲得更接近于體內(nèi)正常RPE的種子細(xì)胞。
　　RPE細(xì)胞的移植方式也影響著其在體內(nèi)的存活與功能發(fā)揮。目前主要包括兩種移植方式:細(xì)胞懸液移植及細(xì)胞片移植。雖然細(xì)胞懸液移植手術(shù)操作較簡(jiǎn)單，但植入的種子細(xì)胞有聚集成團(tuán)，難以形成有極性單層細(xì)胞的問(wèn)題，不利于RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜內(nèi)的功能發(fā)揮。細(xì)胞片移植可維持RPE種子細(xì)胞在視網(wǎng)膜內(nèi)的單層、極性結(jié)構(gòu)，有望提高RPE移植后的效果。組織工程化RPE復(fù)合體是將RPE細(xì)胞體外

4、培養(yǎng)在生物材料上，形成有極性的、有功能的單層RPE細(xì)胞片后，再將生物材料與RPE細(xì)胞片的復(fù)合物移植到視網(wǎng)膜下腔。如今已有多種生物材料被用于構(gòu)建組織工程化RPE復(fù)合體，來(lái)模擬RPE-Bruch膜復(fù)合體，但理想的生物材料需同時(shí)兼顧生物相容性、可降解性、手術(shù)可操作性以及適合RPE細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)等因素。
　　目的:
　　研究ESC經(jīng)三維培養(yǎng)分化而來(lái)的RPE細(xì)胞(3D-RPE)的生物學(xué)特性，獲得最優(yōu)的RPE種子細(xì)胞;探討生物材料對(duì)于

5、RPE細(xì)胞的生物相容性，制備具有良好生物相容性的生物材料，并模擬RPE-Bruch膜復(fù)合體構(gòu)建組織工程化RPE，研究該復(fù)合體生物學(xué)特性以及移植后對(duì)于視網(wǎng)膜變性的挽救作用。
　　方法與結(jié)果:
　　本研究分為三個(gè)部分:
　　第一部分:人胚胎干細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)法誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性研究
　　1、研究3D-RPE細(xì)胞在分化不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和增殖能力，發(fā)現(xiàn)3D-RPE細(xì)胞具有類似于體內(nèi)正常R

6、PE細(xì)胞的鋪路石樣形態(tài)。細(xì)胞頂端出現(xiàn)了大量的微絨毛，色素顆粒主要集中在細(xì)胞質(zhì)上方，細(xì)胞核位于細(xì)胞質(zhì)下方，細(xì)胞膜的頂端和底端都出現(xiàn)了窖蛋白，細(xì)胞之間形成了緊密連接和縫隙連接，粘附連接和橋粒。與分化同一時(shí)間點(diǎn)的SD-RPE細(xì)胞相比，3D-RPE細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng)。
　　2、研究3D-RPE細(xì)胞在分化不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)3D-RPE細(xì)胞在分化至40d時(shí)全基因組表達(dá)譜最接近于人胚胎RPE;隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，3D-RPE細(xì)胞的與分

7、化成熟相關(guān)的基因?qū)⒅饾u上調(diào)，但均低于同一時(shí)間點(diǎn)的SD-RPE細(xì)胞基因表達(dá)水平。
　　3、研究3D-RPE細(xì)胞在分化不同時(shí)間點(diǎn)的吞噬功能、極性、分泌營(yíng)養(yǎng)因子功能、緊密連接和縫隙連接，發(fā)現(xiàn)3D-RPE細(xì)胞比同一時(shí)間點(diǎn)的SD-RPE細(xì)胞形成了更強(qiáng)的細(xì)胞間緊密連接，更早形成了細(xì)胞極性，但吞噬感光細(xì)胞外節(jié)和分泌營(yíng)養(yǎng)因子的功能不如同一分化時(shí)間點(diǎn)的SD-RPE細(xì)胞。
　　第二部分:基于不可降解聚酯薄膜(PET)構(gòu)建的組織工程化人視網(wǎng)膜色素

8、上皮復(fù)合體的研究
　　1、研究3D-RPE細(xì)胞在PET膜上的生長(zhǎng)特性，發(fā)現(xiàn)PET/RPE復(fù)合體形成了有極性的單層細(xì)胞，能夠吞噬感光細(xì)胞外節(jié)、分泌營(yíng)養(yǎng)因子、形成了緊密連接。
　　2、研究基于PET膜的3D-RPE細(xì)胞片移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后對(duì)視功能的影響，發(fā)現(xiàn)PET/RPE復(fù)合體能夠延緩RCS大鼠的視網(wǎng)膜變性，與RPE細(xì)胞懸液無(wú)顯著差異，并且PET/RPE復(fù)合體移植引起了較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
　　第三部分:基于可降解

9、的石墨烯膜構(gòu)建的組織工程化人視網(wǎng)膜色素上皮復(fù)合體的研究
　　1、研究不同修飾的石墨烯納米顆粒對(duì)于眼細(xì)胞的毒性，將不同化學(xué)修飾、不同表面電荷和不同氧化程度的石墨烯納米顆粒與四種眼細(xì)胞（ESC-RPE細(xì)胞，人結(jié)膜上皮細(xì)胞，人角膜上皮細(xì)胞，人血管內(nèi)皮細(xì)胞）共培養(yǎng)后檢測(cè)石墨烯納米顆粒對(duì)于眼細(xì)胞的活力、凋亡、氧化應(yīng)激和線粒體膜電位的影響，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)修飾能夠顯著改善氧化石墨烯(GO)的生物相容性;不同表面電荷的石墨烯納米顆粒對(duì)于眼

10、細(xì)胞的活力、凋亡、氧化應(yīng)激和線粒體膜電位無(wú)顯著差異;石墨烯的氧化程度與眼細(xì)胞的活力呈負(fù)相關(guān)，與眼細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)呈正相關(guān)。
　　2、研究3D-RPE細(xì)胞在PEG修飾后低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)膜上的生長(zhǎng)特性，發(fā)現(xiàn)PEG-GO-S/RPE復(fù)合體能夠分泌營(yíng)養(yǎng)因子并且形成了緊密連接。
　　3、研究基于PEG-GO-S膜的3D-RPE細(xì)胞片移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后的生物相容性，發(fā)現(xiàn)PEG-GO-S/RPE復(fù)合體

11、移植并沒(méi)有引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1、3D-RPE細(xì)胞具有類似于體內(nèi)RPE細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、極性和全基因組表達(dá)譜，并具有吞噬、分泌營(yíng)養(yǎng)因子、形成緊密連接和縫隙連接的功能，是一種新的RPE種子細(xì)胞。
　　2、3D-RPE細(xì)胞隨著在體外分化時(shí)間延長(zhǎng)逐漸成熟，色素加深、增殖能力減弱、細(xì)胞極性形成，吞噬功能、營(yíng)養(yǎng)因子分泌和細(xì)胞之間緊密連接等功能逐漸增強(qiáng);與同一分化時(shí)間點(diǎn)的SD-RPE細(xì)胞相比，3D-RPE細(xì)胞

12、成熟更慢。
　　3、PET膜可用于構(gòu)建有極性、有功能的單層RPE復(fù)合體，PET/RPE復(fù)合體移植后可延緩RCS大鼠視網(wǎng)膜變性，但同時(shí)也會(huì)引起較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
　　4、石墨烯的表面化學(xué)修飾和氧化程度是決定其對(duì)眼細(xì)胞產(chǎn)生生物毒性的主要原因，表面電荷對(duì)于其生物毒性無(wú)顯著影響;PEG修飾后的低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)對(duì)眼細(xì)胞的生物毒性最低，PEG-GO-S膜可用于構(gòu)建有功能的單層RPE細(xì)胞片，PEG-GO-S/RP