組織工程化人視網(wǎng)膜色素上皮復合體的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）是位于神經(jīng)視網(wǎng)膜與Bruch膜之間的單層細胞，具有吞噬感光細胞外節(jié)、分泌營養(yǎng)因子、參與視循環(huán)代謝和形成血一視網(wǎng)膜屏障等功能，對于維持視網(wǎng)膜正常生理功能十分重要。視網(wǎng)膜色素上皮細胞功能受損將導致包括老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、Stargardt's綜合征等致盲性疾病。目前這類疾病尚缺乏有效治療措施，RPE移植有望替代患者受損的RPE，從而保護感光細胞，是目前

2、最有前景的治療措施。
　　RPE種子細胞的來源是制約RPE移植臨床轉(zhuǎn)化的重要因素。胚胎干細胞(embryonicstem cell，ESC)具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力，同時細胞性狀穩(wěn)定，可用于大規(guī)模標準化生產(chǎn)RPE細胞，十分適合于臨床應用。目前，ESC經(jīng)自然分化法誘導而來的RPE細胞(SD-RPE)已進入臨床試驗階段。三維培養(yǎng)是一種全新的ESC誘導分化技術(shù)，已有研究在體外將ESC三維培養(yǎng)分化為視杯樣結(jié)構(gòu)，該方法較好地模

3、擬了視網(wǎng)膜的體內(nèi)發(fā)育過程，有望獲得更接近于體內(nèi)正常RPE的種子細胞。
　　RPE細胞的移植方式也影響著其在體內(nèi)的存活與功能發(fā)揮。目前主要包括兩種移植方式:細胞懸液移植及細胞片移植。雖然細胞懸液移植手術(shù)操作較簡單，但植入的種子細胞有聚集成團，難以形成有極性單層細胞的問題，不利于RPE細胞在視網(wǎng)膜內(nèi)的功能發(fā)揮。細胞片移植可維持RPE種子細胞在視網(wǎng)膜內(nèi)的單層、極性結(jié)構(gòu)，有望提高RPE移植后的效果。組織工程化RPE復合體是將RPE細胞體外

4、培養(yǎng)在生物材料上，形成有極性的、有功能的單層RPE細胞片后，再將生物材料與RPE細胞片的復合物移植到視網(wǎng)膜下腔。如今已有多種生物材料被用于構(gòu)建組織工程化RPE復合體，來模擬RPE-Bruch膜復合體，但理想的生物材料需同時兼顧生物相容性、可降解性、手術(shù)可操作性以及適合RPE細胞的貼壁、生長等因素。
　　目的:
　　研究ESC經(jīng)三維培養(yǎng)分化而來的RPE細胞(3D-RPE)的生物學特性，獲得最優(yōu)的RPE種子細胞;探討生物材料對于

5、RPE細胞的生物相容性，制備具有良好生物相容性的生物材料，并模擬RPE-Bruch膜復合體構(gòu)建組織工程化RPE，研究該復合體生物學特性以及移植后對于視網(wǎng)膜變性的挽救作用。
　　方法與結(jié)果:
　　本研究分為三個部分:
　　第一部分:人胚胎干細胞經(jīng)三維培養(yǎng)法誘導的視網(wǎng)膜色素上皮細胞的細胞生物學特性研究
　　1、研究3D-RPE細胞在分化不同時間點的細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和增殖能力，發(fā)現(xiàn)3D-RPE細胞具有類似于體內(nèi)正常R

6、PE細胞的鋪路石樣形態(tài)。細胞頂端出現(xiàn)了大量的微絨毛，色素顆粒主要集中在細胞質(zhì)上方，細胞核位于細胞質(zhì)下方，細胞膜的頂端和底端都出現(xiàn)了窖蛋白，細胞之間形成了緊密連接和縫隙連接，粘附連接和橋粒。與分化同一時間點的SD-RPE細胞相比，3D-RPE細胞的增殖能力更強。
　　2、研究3D-RPE細胞在分化不同時間點的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)3D-RPE細胞在分化至40d時全基因組表達譜最接近于人胚胎RPE;隨著分化時間的延長，3D-RPE細胞的與分

7、化成熟相關(guān)的基因?qū)⒅饾u上調(diào)，但均低于同一時間點的SD-RPE細胞基因表達水平。
　　3、研究3D-RPE細胞在分化不同時間點的吞噬功能、極性、分泌營養(yǎng)因子功能、緊密連接和縫隙連接，發(fā)現(xiàn)3D-RPE細胞比同一時間點的SD-RPE細胞形成了更強的細胞間緊密連接，更早形成了細胞極性，但吞噬感光細胞外節(jié)和分泌營養(yǎng)因子的功能不如同一分化時間點的SD-RPE細胞。
　　第二部分:基于不可降解聚酯薄膜(PET)構(gòu)建的組織工程化人視網(wǎng)膜色素

8、上皮復合體的研究
　　1、研究3D-RPE細胞在PET膜上的生長特性，發(fā)現(xiàn)PET/RPE復合體形成了有極性的單層細胞，能夠吞噬感光細胞外節(jié)、分泌營養(yǎng)因子、形成了緊密連接。
　　2、研究基于PET膜的3D-RPE細胞片移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后對視功能的影響，發(fā)現(xiàn)PET/RPE復合體能夠延緩RCS大鼠的視網(wǎng)膜變性，與RPE細胞懸液無顯著差異，并且PET/RPE復合體移植引起了較嚴重的炎癥反應。
　　第三部分:基于可降解

9、的石墨烯膜構(gòu)建的組織工程化人視網(wǎng)膜色素上皮復合體的研究
　　1、研究不同修飾的石墨烯納米顆粒對于眼細胞的毒性，將不同化學修飾、不同表面電荷和不同氧化程度的石墨烯納米顆粒與四種眼細胞（ESC-RPE細胞，人結(jié)膜上皮細胞，人角膜上皮細胞，人血管內(nèi)皮細胞）共培養(yǎng)后檢測石墨烯納米顆粒對于眼細胞的活力、凋亡、氧化應激和線粒體膜電位的影響，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)修飾能夠顯著改善氧化石墨烯(GO)的生物相容性;不同表面電荷的石墨烯納米顆粒對于眼

10、細胞的活力、凋亡、氧化應激和線粒體膜電位無顯著差異;石墨烯的氧化程度與眼細胞的活力呈負相關(guān)，與眼細胞的氧化應激反應呈正相關(guān)。
　　2、研究3D-RPE細胞在PEG修飾后低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)膜上的生長特性，發(fā)現(xiàn)PEG-GO-S/RPE復合體能夠分泌營養(yǎng)因子并且形成了緊密連接。
　　3、研究基于PEG-GO-S膜的3D-RPE細胞片移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后的生物相容性，發(fā)現(xiàn)PEG-GO-S/RPE復合體

11、移植并沒有引起嚴重的炎癥反應。
　　結(jié)論:
　　1、3D-RPE細胞具有類似于體內(nèi)RPE細胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、極性和全基因組表達譜，并具有吞噬、分泌營養(yǎng)因子、形成緊密連接和縫隙連接的功能，是一種新的RPE種子細胞。
　　2、3D-RPE細胞隨著在體外分化時間延長逐漸成熟，色素加深、增殖能力減弱、細胞極性形成，吞噬功能、營養(yǎng)因子分泌和細胞之間緊密連接等功能逐漸增強;與同一分化時間點的SD-RPE細胞相比，3D-RPE細胞

12、成熟更慢。
　　3、PET膜可用于構(gòu)建有極性、有功能的單層RPE復合體，PET/RPE復合體移植后可延緩RCS大鼠視網(wǎng)膜變性，但同時也會引起較嚴重的炎癥反應。
　　4、石墨烯的表面化學修飾和氧化程度是決定其對眼細胞產(chǎn)生生物毒性的主要原因，表面電荷對于其生物毒性無顯著影響;PEG修飾后的低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)對眼細胞的生物毒性最低，PEG-GO-S膜可用于構(gòu)建有功能的單層RPE細胞片，PEG-GO-S/RP