LIN28B調控人乳腺癌干細胞干性特征和糖代謝的機制研究.pdf

1、第一部分:LIN28B維持乳腺癌干細胞的干性特征的機制研究
　　研究目的:腫瘤干細胞是腫瘤組織中數(shù)量極少具有干細胞特性的細胞，既表現(xiàn)出干細胞的特性又有腫瘤細胞的特點，是腫瘤耐藥、復發(fā)和轉移的根源。有研究[1]證明CD44high表型的肺癌細胞比CD44low表型的肺癌細胞有更強的成球能力和致瘤性，接種300個CD44high細胞于NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠就可以形成腫瘤，而接種3×104個CD44low

2、細胞或5×105個未分離的混合細胞都不能形成腫瘤。LIN28是一種首先在線蟲C.elegants中發(fā)現(xiàn)的RNA結合蛋白，在其發(fā)育過程中起重要作用;在哺乳動物中LIN28具有結構和功能高度同源的兩種同系物LIN28A和LIN28B[2]。已有研究表明LIN28在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生、轉移密切相關[3-5]。 microRNA是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3'-UTR結合對其進行轉錄后調控[6

3、]。有研究發(fā)現(xiàn)LIN28通過阻止Let-7的加工成熟，影響靶基因的表達從而對調節(jié)細胞代謝和干性發(fā)揮重要作用[7-9]。已有的研究主要是集中在LIN28通過抑制Let-7的加工成熟發(fā)揮調控作用，不過LIN28也能調控其他miRNAs如miR-150[4]。本研究的主要目的是探究LIN28B對乳腺癌干細胞干性特征的調控并通過miRNA測序發(fā)現(xiàn)其他受LIN28B調控的miRNAs并進一步研究miRNA對MCF-7腫瘤干細胞的作用。
　　

4、研究方法:首先檢測惡性程度高的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞和低轉移性MCF-7乳腺癌細胞干性相關基因SOX2、OCT4、NANOG和LIN28B的mRNA和蛋白表達，確定LIN28B在惡性程度不同的乳腺癌細胞中的表達水平。然后在MCF-7細胞轉染p-CMV6-LIN28B質粒瞬時過表達LIN28B，通過RNA測序找出差異表達的miRNAs，并進一步通過病毒感染方法在MCF-7細胞建立穩(wěn)定過表達LIN28B細胞系，檢測干性相關基因

5、mRNA和蛋白的表達、利用流式細胞儀檢測CD44highCD24low細胞比例和通過成球培養(yǎng)比較體外成球能力。最后在MCF-7細胞轉染該差異表達的miRNA mimic，檢測CD44highCD24low細胞比例和比較體外成球能力。
　　研究結果:
　　1.LIN28B在惡性程度高的MDA-MB-231細胞表達顯著增高。
　　2.LIN28B能明顯上調MCF-7細胞SOX2、OCT4和NANOG的表達。
　　3.

6、LIN28B能上調MCF-7細胞中CD44highCD24low細胞比例和促進MCF-7細胞的體外成球能力。
　　4.MCF-7細胞過表達LIN28B后miR-92b-5p表達上調，miR-4521、miR-149-3p和miR-92a-1-5p表達下調。
　　5.MCF-7細胞轉染miR-92b-5p mimic后CD44highCD24low細胞比例增高并且體外成球能力增強。
　　結論:通過調控miR-92b-5p

7、的表達是LIN28B促進乳腺癌MCF-7細胞干性特征的機制之一。
　　第二部分:LIN28B調控乳腺癌干細胞糖代謝的機制研究
　　研究目的:葡萄糖是細胞最主要的能量來源，正常細胞攝取葡萄糖后，在氧氣充足的條件下，通過三羧酸循環(huán)將葡萄糖徹底氧化成CO2和H2O，僅在低氧條件下，細胞進行糖酵解生成乳酸。但與正常細胞不同的是，腫瘤細胞不管是在氧氣充足還是低氧條件都以糖酵解的方式提供能量，這就是著名的“Warburg effect”

8、。2012年Hanahan和Weinberg將細胞能量代謝異常總結為腫瘤的十大特征之—[46]，近年來腫瘤細胞的這種特殊的代謝方式重新受到廣泛關注，其形成的機制及對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等影響也成為研究的熱點。但是目前關于腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)的代謝狀態(tài)還不是很清楚，CSCs可以根據(jù)不同的條件對自身的代謝狀態(tài)進行調整，以適應環(huán)境的變化。已有研究[47，48]發(fā)現(xiàn)靜息的CSCs細胞的代謝狀態(tài)對Vermeers

9、ch有重要的調節(jié)作用，有研究指出糖酵解對維持CSCs的干性至關重要[49]，Vemeersch等[50]通過對普通卵巢癌細胞和卵巢癌干細胞進行質譜分析發(fā)現(xiàn)，這兩類細胞的代謝表型不同，卵巢癌干細胞對葡萄糖的依賴程度高于普通卵巢癌細胞。本課題主要研究人乳腺癌干細胞的糖代謝狀態(tài)以及LIN28B在該代謝過程中的調控機制和糖代謝方式與維持乳腺癌干細胞的干性特征之間的關系，為了解腫瘤干細胞及腫瘤治療提供新思路。
　　研究方法:首先我們利用體外

10、成球培養(yǎng)的方法富集MDA-MB-231細胞的腫瘤干細胞并用孔徑70μm細胞篩過濾細胞球;然后用細胞能量代謝分析儀檢測細胞球和貼壁細胞中線粒體呼吸功能和糖酵解功能，用western blot檢測糖酵解關鍵分子PKM2、LDHA和HIF-1α的蛋白表達。然后使用實驗室已建立的病毒感染方法沉默LIN28B基因的穩(wěn)定MDA-MB-231細胞系，用細胞能量代謝分析儀比較對照組和shLIN28B組細胞的線粒體呼吸功能和糖酵解功能;用TALEN技術敲

11、除MDA-MB-231細胞的LIN28B基因，用流式細胞儀檢測野生型細胞和LIN28B敲除細胞對2-NBDG的攝取并比較這兩組細胞對葡萄糖的攝取。最后用LDHA活性檢測試劑盒檢測細胞球和貼壁細胞的LDHA活性;在MDA-MB-231細胞和H1299細胞加入LDHA抑制劑oxamate，用CCK8試劑檢測不同濃度oxamate對細胞活性的影響，通過體外成球培養(yǎng)比較不同濃度oxamate對MDA-MB-231細胞的體外成球能力。
　　

12、研究結果:
　　1.乳腺癌干細胞的有氧糖酵解增強而線粒體的氧化磷酸化被抑制且高表達糖酵解關鍵分子PKM2、LDHA和HIF-1α。
　　2.LIN28B能促進MDA-MB-231細胞表達糖酵解關鍵分子PKM2、LDHA和HIF-1α，使MDA-MB-231細胞攝取葡萄糖增多。
　　3.LIN28B促進MDA-MB-231細胞糖酵解并且抑制線粒體的氧化磷酸化。
　　4.LIN28B能與LDHA和HIF-1α的mRN