P2x7受體基于NLRP3炎癥小體調(diào)控酒精性脂肪肝和肝纖維化的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:肝纖維化是一種發(fā)生在肝臟、循序而漸進(jìn)的病理?yè)p傷，隨著肝纖維化研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)肝纖維化過(guò)程中炎癥反應(yīng)始終貫穿始終。P2x7受體(purinergicreceptor, P2x7R)屬于嘌呤受體家族，是P2x家族的7個(gè)不同亞型(P2x1-7)中的一種。它在人體中分布廣泛，特別是與炎癥反應(yīng)過(guò)程直接相關(guān)。因而是否可以通過(guò)影響P2x7R來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)酒精性脂肪肝的調(diào)控，摸索其中的潛在聯(lián)系與機(jī)制，是我們要探究的問(wèn)題。
　　方法:(1)脂多

2、糖（lipopolysaccharide，LPS）預(yù)處理巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基間接刺激人系肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞與直接LPS刺激LX2細(xì)胞的組別相比較，ELISA與Western Blot檢測(cè)細(xì)胞因子白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)表達(dá)情況。Western Blot與RT-PCR

3、檢測(cè)蛋白與mRNA的表達(dá)水平;LX2細(xì)胞給予LPS刺激4h，加入三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)時(shí)間為30min，加入ATP前10min給予P2x7R拮抗劑A438079。Western Blot與RT-PCR驗(yàn)證LX2細(xì)胞激活過(guò)程中炎癥因子P2x7R、NOD樣受體家族成員(NLRs) NLRP3和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specificproteinas

4、，caspase-1)表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)肝纖維化標(biāo)志蛋白Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen，collagenⅠ)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)蛋白mRNA表達(dá)情況;沉默P2x7R后檢測(cè)相關(guān)炎癥小體與肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。(2)建立硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)肝纖維化模型，采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:正常組(n=5)，模型TAA組(n=14)與模型TAA給藥

5、A438079組(n=5)。除正常組，第一周腹腔注射給予TAA(100 mg/kg)給藥，從第二周到第六周內(nèi)TAA(200mg/kg)，從第5周起給藥組每周給予A438079（30mg/kg）3次，持續(xù)兩周。第6周給藥結(jié)束后處死，收取血清，肝臟等樣本。蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、免疫組化法(Immunohistochemistry, IHC)、麻松三色染色(Masson's Tric

6、hrome Staining)、免疫熒光染色(ImmunofluorescenceStaining，IF)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子NLRP3、核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor kB，NF-kB)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和F4/80的表達(dá)情況。結(jié)合Western Blot與RT-PCR檢測(cè)肝纖維化相關(guān)標(biāo)志collagenⅠ、α-SMA的表達(dá)。(3)對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞(AML12)給予酒精(50mM)、二甲雙胍與

7、AMP依賴的蛋白激酶(AMPdependent kinase，AMPK)通路抑制劑Compound C刺激24h，利用Wertern Blot檢測(cè)炎癥因子與脂肪代謝相關(guān)沉默信息調(diào)節(jié)因子（Sirtuin1，SIRT1）、過(guò)氧化物增殖劑激活受體(Peroxisome proliferatoractivated Receptor-alpha, PPARα)蛋白表達(dá)結(jié)果，凋亡相關(guān)因子半胱天冬酶3，即caspase-3表達(dá)情況。(4)慢性酒精加急

8、性酒精灌胃模型，采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照飼料組，慢性酒精加酒精急性灌胃組，酒精給藥組以及單獨(dú)給藥組。給藥組每天皮下注射給藥A438079(30mg/kg)。實(shí)驗(yàn)階段，分別給予對(duì)照飼料與酒精飼料10天喂養(yǎng)。第11天單次酒精灌胃的計(jì)量為5g/kg，9小時(shí)后處死并收集樣本。利用Western Blot與RT-PCR檢測(cè)炎癥因子與肝纖維化標(biāo)志因子的蛋白與mRNA表達(dá)情況，對(duì)肝臟病理切片進(jìn)行染色分析肝纖維化與炎癥因子浸潤(rùn)情況。

9、r>　　結(jié)果:(1) LX2細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS刺激后分泌IL-1β和IL-1α。LX2細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS與ATP聯(lián)合作用，肝纖維化相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)collagenⅠ、α-SMA以及P2x7R和caspase-1、NLRP3炎癥小體的mRNA與蛋白表達(dá)升高;預(yù)處理P2x7R拮抗劑A438079可以有效降低上述因子的表達(dá)。(2) TAA所致的肝纖維化模型中，A438079可以在體內(nèi)降低TAA引起的caspase-1、NLRP3炎癥小體與纖維化指標(biāo)標(biāo)co

10、llagenⅠ、α-SMA和TIMP1的蛋白與mRNA表達(dá)，在病理學(xué)上改善模型組的病變情況。(3)在AML12細(xì)胞中，A438079可以有效降低酒精誘發(fā)的PPARα、caspase-3、P-AMPK、SIRT1的蛋白表達(dá)。(4)慢性加急性酒精灌胃模型中，P2x7R拮抗劑A438079可以降低酒精誘發(fā)的ALT/AST指標(biāo)升高，在病理學(xué)上改善模型組的病變情況以及collagenⅠ、α-SMA、P-AMPK、SIRT1、LIPIN1的蛋白表達(dá)