PIM-1基因?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力和增殖周期的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景：
　　心肌梗死（Myocardial Infarcion,MI)是引起缺血性心肌?。↖schemic Cardiomyopathy,ICM)產(chǎn)生心力衰竭(Heart Failure,HF)的主要病因之一,嚴(yán)重影響人類的健康水平和生活質(zhì)量。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死后部分心肌細(xì)胞仍可以進(jìn)行分裂增殖,但是每年的更新率僅為1％,不能彌補(bǔ)梗死區(qū)域損失的心肌細(xì)胞數(shù)量[1]。目前,臨床上MI的治療方法均無(wú)法挽救已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞。隨著對(duì)干

2、細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入,發(fā)現(xiàn)將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞后移植到心梗區(qū)域能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞再生從而改善心功能,這一研究發(fā)現(xiàn)為MI的治療帶來(lái)了新的希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem cells,BMMSCs)因具有多向分化潛能、高效的自我更新能力以及取材容易等特性已經(jīng)成為干細(xì)胞的研究熱點(diǎn),然而,BMMSCs在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的衰老問(wèn)題限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。近期研究發(fā)現(xiàn),PIM-1是Akt信號(hào)

3、通路中重要的下游調(diào)節(jié)因子,廣泛的參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、凋亡等生理過(guò)程,具有提高細(xì)胞增殖能力的生物學(xué)作用。但PIM-1對(duì)BMMSCs增殖能力的調(diào)控作用和對(duì)細(xì)胞增殖周期的影響尚不清楚。
　　目的：
　　(1)研究大鼠BMMSCs體外分離培養(yǎng)的方法以及各代BMMSCs的增殖規(guī)律。
　　(2)探討PIM-1對(duì)大鼠BMMSCs增殖能力和凋亡的影響。
　　(3)探索PIM-1對(duì)大鼠BMMSCs衰老的調(diào)控作用。
　　方

4、法：
　　(1)大鼠BMMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定:采用密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs,傳代以純化細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀鑒定第4代(P4) BMMSCs表面抗原。應(yīng)用倒置光學(xué)顯微鏡觀察各代BMMSCs的形態(tài)學(xué)特征。
　　(2)BMMSCs的轉(zhuǎn)染:將 P4 BMMSCs接種于24孔板中,分為空白對(duì)照組(BMMSCs組),egfp轉(zhuǎn)染組(BMMSCe組)和PIM-1-egfp轉(zhuǎn)染組(BMMSCep組),每組細(xì)胞設(shè)

5、3個(gè)復(fù)孔,分別將 Lv-egfp轉(zhuǎn)入 BMMSCe組,將 Lv-egfp-PIM-1轉(zhuǎn)入BMMSCep組。
　　(3)PIM-1基因和TERT基因的表達(dá)檢測(cè):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)P4 BMMSCep組和P9 BMMSCep組中PIM-1基因表達(dá)水平和P9 BMMSCep組中TERT基因的表達(dá)水平,應(yīng)用2(-△△ct)法分析。應(yīng)用 Western Blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PIM-1蛋白的表達(dá)水平并進(jìn)行半定量分析。

6、r>　　(4)細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的檢測(cè):采用MTT法檢測(cè)各代BMMSCs的細(xì)胞增殖能力和經(jīng) PIM-1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化并繪制細(xì)胞增殖曲線。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)各代BMMSCs的細(xì)胞周期及經(jīng)PIM-1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)BMMMSCs的形態(tài)學(xué)變化及鑒定:原代細(xì)胞體積小,形態(tài)多變,呈梭形或星形,可見(jiàn)細(xì)胞突起從胞質(zhì)內(nèi)伸出。P3～ P9 BMMSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,P3 BMMSCs細(xì)胞

7、排列緊密,呈長(zhǎng)梭形,形態(tài)均一;P9 BMMSCs細(xì)胞胞體明顯增寬,長(zhǎng)梭形形態(tài)消失,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。流式細(xì)胞儀鑒定BMMSCs表面抗原的結(jié)果顯示,CD29表達(dá)率為(96.2±2.1)%,CD44表達(dá)率為(94.2±3.2)%,CD45表達(dá)率為(2.1±1.3)%。
　　(2)BMMSCs細(xì)胞增殖規(guī)律及細(xì)胞周期的檢測(cè): P3～ P9 BMMSCs組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈S形。在第1d~2d處于潛伏期,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;在第3d~5d時(shí),細(xì)胞進(jìn)

8、入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,增殖加速;至第6 d時(shí),細(xì)胞增殖速度減慢,P3、P5、P7、P9 BMMSCs細(xì)胞光吸收值分別為:0.591±0.132、0.560±0.179、0.527±0.164、0.458±0.121,說(shuō)明P3～P5細(xì)胞增殖良好,P9細(xì)胞增殖不良(P<0.05)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著傳代次數(shù)的增加處于增殖期的細(xì)胞比例下降,P9中處于增殖期的細(xì)胞比例最低(P<0.05)。說(shuō)明BMMSCs在體外培養(yǎng)時(shí),隨著傳代次數(shù)的增多,細(xì)胞增

9、殖能力逐漸降低,當(dāng)傳至第9代時(shí),BMMSCs進(jìn)入衰老狀態(tài)。
　　(3)PIM-1對(duì)大鼠BMMSCs增殖能力和凋亡的影響:應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的PIM-1轉(zhuǎn)染P4 BMMSCs后,BMMSCs組、BMMSCep組和BMMSCe組中PIM-1基因的表達(dá)量分別為(0.71±0.065)bp、(1.40±0.198)bp和(0.72±0.105)bp,BMMSCep組中PIM-1基因的表達(dá)量顯著高于BMMSCs組和BMMSCe組(P<0.05)

10、。Western blot及半定量分析結(jié)果顯示,BMMSCep組中 PIM-1蛋白的表達(dá)水平顯著高于BMMSCs組和BMMSCe組(P<0.05)。在6 d時(shí),BMMSCs組、BMMSCe組和BMMSCep組吸光度值分別為0.52±0.029、0.54±0.041、0.72±0.031,BMMSCep組的細(xì)胞增殖能力顯著高于BMMSCs組和BMMSCe組(P<0.05),說(shuō)明PIM-1能夠顯著提高 BMMSCs的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)

11、細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,BMMSCs組、BMMSCe組及BMMSCep組的凋亡數(shù)目百分率為(12.9±1.51)%、(13.8±2.57)%、(5.03±0.74)%,BMMSCep組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低(P<0.05),說(shuō)明PIM-1能夠抑制BMMSCs凋亡。
　　(4)PIM-1對(duì)BMMSCs衰老的影響:應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的PIM-1轉(zhuǎn)染P9 BMMSCs后,P9 BMMSCs組、P9 BMMSCep組和P9 BMMSCe組TERT基因

12、的表達(dá)量分別為(1.02±0.082)bp、(2.273±0.153)bp和(1.08±0.183)bp,BMMSCep組中TERT基因的表達(dá)量顯著高于BMMSCs組和BMMSCe組(P<0.05),說(shuō)明在P9 BMMSCs中過(guò)表達(dá)PIM-1能夠顯著提高TERT基因的表達(dá)水平。在第6 d時(shí),P5 BMMSCs組、P7 BMMSCs組、P9 BMMSCs組、P9 BMMSCe組和P9 BMMSCep組的吸光度值分別為0.560±0.179

13、、0.527±0.164、0.450±0.120、0.460±0.198和0.534±0.137,P9 BMMSCep組的細(xì)胞增殖能力顯著高于P9 BMMSCs組和P9 BMMSCe組(P<0.05),而P9 BMMSCep組與P7 BMMSCs組的細(xì)胞增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示PIM-1能夠促進(jìn)P9 BMMSCs由G0/G1期進(jìn)入S期,顯著提高了細(xì)胞的增殖能力,并延緩了P9 BMMSCs衰老進(jìn)程。

14、>　　結(jié)論：
　　(1)采用密度梯度離心聯(lián)合差速貼壁的方法可以獲得高純度的BMMSCs,隨著體外傳代次數(shù)的增多,細(xì)胞增殖能力逐漸降低,傳至第9代后BMMSCs逐漸進(jìn)入衰老狀態(tài)。
　　(2)應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的PIM-1轉(zhuǎn)染P4 BMMSCs后,P4 BMMSCs增殖能力提高,凋亡數(shù)目減少。
　　(3)應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的PIM-1轉(zhuǎn)染P9 BMMSCs后,能夠促使P9 BMMSCs由G0/G1期進(jìn)入S期,提高P9 BMMSCe