YAP1促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞厄洛替尼耐藥的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　截止目前，肺癌已經(jīng)成為人類癌癥死亡的主要原因。我國(guó)的肺癌發(fā)病率與死亡率居高不下，其占男性肺癌發(fā)病率的第一位，在女性中也僅次于乳腺癌。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的病理類型，約占全部肺癌病理類型的85％。隨著基因水平和腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，針對(duì)于肺癌驅(qū)動(dòng)基因的分子靶向治療已取得重大突破。其中，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal gro

2、wthfactor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)代表性藥物厄洛替尼(erlotinib，ER)和吉非替尼(gefitinib)已成為EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案，其中位無(wú)進(jìn)展生存期(progress-free survival，PFS)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的放療與化療。遺憾的是，患者在TKIs治療后的6到12個(gè)月均不可避免地發(fā)生耐藥。NSCLC的EGFR

3、-TKIs耐藥機(jī)制已成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信號(hào)通路中最核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控共激活因子，定位于人類染色體11q22，共有兩種結(jié)構(gòu)亞型:YAP1和YAP2，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。隨著研究的深入，YAP基因在耐藥中的作用越來(lái)越受到重視。相關(guān)研究表明，YAP1基因的表達(dá)在NSCLC中上調(diào)，且在肺腺癌中尤為顯著;同時(shí)YAP1在耐西妥昔單抗的

4、NSCLC細(xì)胞中也表達(dá)增高。AXL是率先在白血病細(xì)胞分離出來(lái)的癌基因，屬于受體酪氨酸激酶家族（RTKs）成員之一，可以通過(guò)結(jié)合配體生長(zhǎng)阻滯特異基因6(growth arrest-specific，GAS6)激活下游信號(hào)通路。有研究表明AXL的過(guò)度激活參與了EGFR-TKIs耐藥，與此同時(shí)YAP1通過(guò)調(diào)控AXL也參與了肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但在NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥中，YAP1是否通過(guò)調(diào)控AXL起作用，我們尚未見(jiàn)報(bào)道

5、。
　　本實(shí)驗(yàn)擬采用PC-9敏感細(xì)胞和前期誘導(dǎo)建立的耐厄洛替尼PC-9(PC-9/ER)細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)YAP1和相關(guān)靶基因在人肺腺癌厄洛替尼耐藥中的作用和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，期望為認(rèn)識(shí)NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥的機(jī)制提供新的思路，為克服此種耐藥提供一個(gè)有效靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1、觀察PC-9敏感細(xì)胞和前期誘導(dǎo)建立的PC-9/ER細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，利用CellCounting Kit-8(CCK-8)

6、法檢測(cè)PC-9/ER的耐藥性。
　　2、在PC-9敏感細(xì)胞和PC-9/ER細(xì)胞中，利用qRT-PCR、Western blot和間接免疫熒光方法，檢測(cè)YAP1、AXL和p-AKT的表達(dá)變化。
　　3、以PC-9/ER細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建慢病毒載體shRNA-YAP1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后YAP1及AXL的表達(dá)。Western blot檢測(cè)YAP1及下游AXL、p-AKT的表達(dá)變化;利用CCK-8法檢測(cè)干擾Y

7、AP1基因后對(duì)PC-9/ER細(xì)胞耐藥性的影響。
　　4、在PC-9細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AXL基因，在PC-9/ER細(xì)胞中同時(shí)干擾YAP1和過(guò)表達(dá)AXL基因;Western blot檢測(cè)YAP1及下游AXL、p-AKT的表達(dá)變化;利用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PC-9、PC-9/ER細(xì)胞耐藥性的變化。
　　結(jié)果:
　　1、課題組前期通過(guò)大劑量沖擊(1-5μM)和低劑量誘導(dǎo)成功建立PC-9/ER細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)IC50值和耐藥

8、指數(shù)。PC-9細(xì)胞和PC-9/ER細(xì)胞的IC50值分別為(0.10±0.02)μM和(8.68±1.17)μM，PC-9/ER細(xì)胞耐藥指數(shù)為90.92±14.06。與親代PC-9細(xì)胞相比較，YAP1、AXL和p-AK在PC-9/ER細(xì)胞中mRNA和蛋白水平均有明顯升高(P＜0.05)。
　　2、構(gòu)建慢病毒干擾載體LV-YAP1-RNAi，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC-9/ER細(xì)胞，干擾效率達(dá)52％左右。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi的PC-9/

9、ER細(xì)胞中YAP1、AXL和p-AKT蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05);而IC50值由未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的(8.57-±-0.65)μM降低為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi PC-9/ER細(xì)胞的(1.28±-0.16)μM(P＜0.05)，耐藥指數(shù)約降為原來(lái)的1/7。
　　3、通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染在PC-9細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AXL基因，AXL mRNA表達(dá)水平升高34倍。相應(yīng)的AXL和p-AKT蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.0

10、5)。PC-9細(xì)胞的IC50值由轉(zhuǎn)染前的(0.11±0.02)μM升高到轉(zhuǎn)染后的(1.41±0.36)μM(P＜0.05)。
　　4、通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染在PC-9/ER細(xì)胞中同時(shí)敲低YAP1和過(guò)表達(dá)AXL基因，AXL mRNA表達(dá)水平與只敲低YAP1對(duì)照組相比升高2.6倍。相應(yīng)的AXL和p-AKT蛋白表達(dá)水平較只敲低YAP1對(duì)照組升高(P＜0.05)。PC-9/ER細(xì)胞的IC50值由單獨(dú)轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi的(1.23±0.1

11、5)μM升高到共轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi和LV-AXL的(2.90-±-0.27)μM（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、YAP1基因的表達(dá)上調(diào)在人肺腺癌細(xì)胞厄洛替尼耐藥中起一定作用，且該調(diào)控作用可能與激活下游的AXL酪氨酸激酶和p-AKT有關(guān)。
　　2、抑制YAP1基因表達(dá)可以部分恢復(fù)PC-9/ER細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性，同時(shí)下調(diào)了下游靶蛋白AXL和p-AKT的表達(dá)。
　　3、過(guò)表達(dá)AXL基因可以增強(qiáng)P