IGF-1R在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、我國是肺癌發(fā)生率和死亡率最高的國家之一。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占3/4，是主要病理類型。近年來，隨著基礎(chǔ)研究和臨床隨機(jī)對照研究的不斷深入，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)已經(jīng)成為NSCLC的重要靶點(diǎn)。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的出現(xiàn)和應(yīng)用不僅為NS

2、CLC患者帶來了更長的生存時(shí)間，同時(shí)也大大提高了患者的生存質(zhì)量。然而，隨之而來的EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥這一棘手問題也困擾著廣大臨床工作者。其機(jī)制目前已較明確的有c-met擴(kuò)增、T790M突變和原突變外顯子二次突變等，而IGF-1R的擴(kuò)增在NSCLC耐藥中的作用，近來也越來越受到關(guān)注。IGF-1R擴(kuò)增機(jī)制如何？有何調(diào)控因素等問題至今仍未得到充分解釋。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來研究較廣泛和深入的一類小的非編

3、碼RNA，它參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等多步驟多過程，在多種類型腫瘤發(fā)病中分別發(fā)揮促癌或抑癌的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC中miR-223表達(dá)降低;應(yīng)用生物信息學(xué)及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-1受體(Insulin like growth factor1receptor，IGF-1R)是miR-223的靶基因之一。既然在NSCLC EGFR-TKIs治療耐藥中有IGF-1R擴(kuò)增機(jī)制參與，那么可以推測，miR-

4、223可能通過調(diào)控IGF-1R信號通路而在NSCLCEGFR-TKIs治療耐藥中發(fā)揮重要作用?；谝陨显O(shè)想，本實(shí)驗(yàn)采用課題組前期誘導(dǎo)的耐厄洛替尼PC-9細(xì)胞（PC-9/ER細(xì)胞）及其親本PC-9肺腺癌細(xì)胞為研究對象，探討IGF-1R在NSCLC EGFR-TKIs靶向治療耐藥中的作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　目的:
　　在細(xì)胞水平及裸鼠移植瘤模型中研究IGF-1R在NSCLC細(xì)胞EGFR-TKIs耐藥的機(jī)制，以及miR-223在這

5、一過程中的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代PC-9/ER細(xì)胞，并與親本PC-9肺腺癌細(xì)胞比較，利用CellCounting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測PC-9/ER的耐藥性。
　　2.應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建miR-223過表達(dá)PC-9/ER細(xì)胞(PC-9/ER-miR-223)及對照空載體PC-9/ER細(xì)胞(PC-9/ER-EV)。
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)GFP熒光純化轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　

6、　4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-9/ER-miR-223細(xì)胞及PC-9/ER-EV細(xì)胞在1μM厄洛替尼作用48h后的凋亡率。
　　5.檢測PC-9細(xì)胞、PC-9/ER細(xì)胞、PC-9/ER-miR-223細(xì)胞及PC-9/ER-EV細(xì)胞中IGF-1R的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　6.利用IGF-1激動IGF-1R表達(dá)，觀察其最佳激動作用的濃度及時(shí)間。
　　7.Western blot方法檢測PC-9細(xì)胞、PC-9/ER細(xì)胞

7、、PC-9/ER-miR-223細(xì)胞及PC-9/ER-EV細(xì)胞中IGF-1R/AKT/S6信號通路表達(dá)水平。
　　8.構(gòu)建裸鼠成瘤模型，觀察各組裸鼠移植瘤體積大小及生存情況。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代PC-9細(xì)胞系。
　　2.成功構(gòu)建慢病毒過表達(dá)miR-223過表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC-9/ER細(xì)胞。
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)成功分選出攜帶GFP熒光的PC-9/ER-miR-223細(xì)胞及PC-9/ER

8、-EV細(xì)胞，陽性率分別為95.6％和97％，熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長情況，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)方圓，成簇生長，呈綠色熒光。
　　4.qRT-PCR方法檢測PC-9/ER細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223前后mRNA水平表達(dá)差異，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較對照組升高約16倍(p＜0.05)。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-9/ER-miR-223組細(xì)胞凋亡率（18.92±2.123）是PC-9/ER-EV組（11.13±1.127％）的1.7倍(p＜0.0

9、5)。
　　6.CCK-8法檢測PC-9、PC-9/ER、PC-9/ER-miR-223、PC-9/ER-EV組細(xì)胞的IC50分別為0.25，5.16，1.19和5.29μM(p＜0.05)。
　　7.PC-9/ER細(xì)胞中IGF-1R mRNA水平是其親本細(xì)胞PC-9的2.85倍(p＜0.05)，蛋白水平是PC-9的1.75倍(p＜0.05)。
　　8.PC-9/ER-miR-223細(xì)胞中IGF-1R mRNA水平較其

10、對照組PC-9/ER-EV細(xì)胞降低了43％(p＜0.05)，蛋白水平較對照組降低了34％(p＜0.05)。
　　9.IGF-1R及其下游分子AKT、S6在PC-9/ER中過表達(dá)，而過表達(dá)的miR-223可靶向抑制IGF-1R/AKT/S6信號通路，且其抑制作用可被外源性IGF-1恢復(fù)。
　　10.體外實(shí)驗(yàn)中，PC-9/ER組瘤體大小明顯大于PC-9組(p＜0.05)，PC-9/ER-miR-223組明顯小于PC-9/ER-E