Myrothecine A通過miR-221調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及樹突狀細(xì)胞成熟機(jī)制的研究.pdf

1、Myrothecine A是從黃花蒿內(nèi)生真菌Myrothecium roridum IFB-E012發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的、具有細(xì)胞毒性的10，13環(huán)單端孢霉烯型大環(huán)內(nèi)酯類化合物。已有文獻(xiàn)報(bào)道了該化合物的絕對構(gòu)型，并初步探討了其在內(nèi)共生和生物催化方面的潛在意義。本論文旨在探討myrothecine A體外抗腫瘤的初步機(jī)制以及它在免疫調(diào)節(jié)方面的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-221是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)者，它能與其靶基因的3'UTR區(qū)結(jié)

2、合，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因進(jìn)行調(diào)控，起著癌基因的作用，廣泛參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程。樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)抗原遞呈功能最強(qiáng)大的細(xì)胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNAs能廣泛參與DC發(fā)育、分化、成熟等過程。因此，本論文從以下兩個方面探討myrothecine A對miR-221的調(diào)節(jié)作用以及對肝癌細(xì)胞增殖和DC成熟的影響:一、研究myrothecine A通過m

3、iR-221對肝癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制;二、觀察myrothecineA通過miR-221對DC成熟的影響，以期為myrothecineA成為新的抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　首先，我們研究myrothecineA通過miR-221對肝癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。我們用不同濃度的myrothecineA處理人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，MTT法檢測肝癌細(xì)胞的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)myrothecineA濃度達(dá)到1μg/mL時

4、，能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并且隨著濃度的增加，myrothecineA對肝癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。接下來，我們使用不同濃度的myrothecineA分別處理人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721后，采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，myrothecine A能將細(xì)胞阻滯在S期。為了進(jìn)一步探討myrothecine A誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞S期阻滯及抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們建立了miR-221過表達(dá)細(xì)胞模型，然后觀察myrothecine

5、A是否可通過miR-221抑制肝癌細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒后，SMMC-7721細(xì)胞中miR-221的表達(dá)明顯增高，相比于對照組，miR-221能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。然后，加入1μg/mL myrothecine A后，這種促進(jìn)作用能明顯被抑制，表明myrothecineA能逆轉(zhuǎn)miR-221引起的肝癌細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步探討其機(jī)制，我們用1μg/mL myrothecine A處理miR-221過表達(dá)的

6、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，24h后，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-221的表達(dá)水平，并用Westem blot檢測miR-221的靶基因p27kip1(下文記作p27)的表達(dá)。結(jié)果顯示，myrothecine A能顯著抑制miR-221的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒后，p27的表達(dá)水平明顯下降。但加入1μg/mL myrothecine A后，p27的表達(dá)水平可明顯增加。以上結(jié)果說明，myrothecin

7、e A能通過抑制miR-221的表達(dá)而影響p27的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖。
　　其次，我們觀察myrothecine A通過miR-221對DC成熟的影響。在DC成熟過程中，抗原遞呈能力逐漸增強(qiáng)，并高水平表達(dá)表面共刺激分子，如CD86、CD40、CD80等，因此，我們首先將未成熟的小鼠DC與miR-221過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Hepa1-6（小鼠肝癌細(xì)胞株）共培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面CD86和CD40分子的表達(dá)水平。結(jié)果

8、顯示，miR-221過表達(dá)能顯著抑制DC表面CD86和CD40的表達(dá)，表明miR-221可抑制DC的成熟。接下來，我們在未成熟的小鼠DC與miR-221過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Hepa1-6共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，又加入1μg/mL myrothecine A，作用24h后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入myrothecineA后，DC表面CD86和CD40分子的表達(dá)都有不同程度的增加，提示myrothecineA能逆轉(zhuǎn)miR-221對DC成熟的抑

9、制作用。這些結(jié)果表明，myrothecine A能通過miR-221調(diào)控肝癌微環(huán)境中DC的成熟。而細(xì)胞因子如Arg-1、TGF-β、iNOS、IL-10、IP-10等可抑制免疫細(xì)胞的分化、成熟及功能，為探明miR-221抑制DC成熟的機(jī)制，我們將miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒感染Hepa1-6后，收集細(xì)胞，提取mRNA，實(shí)時熒光定量PCR檢測這些細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有IP-10的表達(dá)明顯增加，提示miR-221可能通過增加IP-