疏水化半乳糖修飾的薏苡仁組分微乳增強肝腫瘤靶向研究.pdf

1、薏苡仁為禾本科薏苡（Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen(Roman)Stapf）的干燥成熟種仁，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁中含有酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內(nèi)酰胺類等活性成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖等作用。作為薏苡仁的主要抗腫瘤活性成分，薏苡仁油已被臨床用于抗肝腫瘤治療；而薏苡仁中另一類抗腫瘤活性成分是薏苡仁多糖，在免疫功能的調(diào)節(jié)方面作用明確。但是，兩者的理化性質(zhì)缺陷導(dǎo)致了其腸道吸收較差，目前以增強其口服

2、吸收為目的的口服新劑型研究尚處于起步階段。微乳作為新型的納米載體之一，是一種由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)比例制得的一種透明、黏度低、且熱力學(xué)穩(wěn)定的溶液體系，其粒徑較小、穩(wěn)定性較好，能夠促進難溶性藥物的口服吸收。本課題組前期研究中以薏苡仁油為微乳油相，荷載靈芝三萜，制備了薏苡仁油-靈芝三萜組分微乳，有效地提高了薏苡仁油及靈芝三萜的體內(nèi)吸收。然而，微乳遞送系統(tǒng)主要依靠EPR效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤部位的特異性聚集，為實現(xiàn)進一步提高對腫瘤

3、細胞的識別能力，表面修飾可腫瘤靶向的小分子配體是一種切實可行的辦法。本研究以薏苡仁中薏苡仁油及多糖兩種抗腫瘤活性組分，制備了薏苡仁組分微乳（Coix seed components-based microemulsions, C-MEs）；并且利用肝腫瘤細胞膜表面去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）能特異性識別具有半乳糖片段的小分子特點，設(shè)計合成了三種不同構(gòu)象的疏水化半乳糖酯，并將其修飾于C-MEs表面得到半乳糖酯修飾的薏苡仁組分微乳（Ga

4、lactose ester-modified coix seed components-based microemulsions，Gal-C-MEs），以期待進一步提高薏苡仁組分微乳的肝腫瘤靶向和抗腫瘤作用。課題通過對所設(shè)計的微乳進行系統(tǒng)地藥劑學(xué)性質(zhì)表征、細胞水平的靶向和抗腫瘤考察、體內(nèi)水平的腫瘤分布和抗腫瘤評價，為探索有中醫(yī)藥特色的中藥多組分腫瘤靶向納米制劑提供理論依據(jù)和實踐探索。本文主要研究內(nèi)容如下：
　　1.不同分子構(gòu)象半乳

5、糖酯的合成及表征
　　分別以辛酸乙烯酯、丁酸乙烯酯及醋酸乙烯酯與半乳糖為原料，在Novozym435固定化脂肪酶的催化下合成辛酰半乳糖酯（ Gal(oct)）、丁酰半乳糖酯（Gal(but)）及乙酰半乳糖酯（Gal(ace)）。反應(yīng)條件：辛酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、
　　醋酸乙烯酯與半乳糖摩爾比均為1:1，60℃油浴，回流反應(yīng)12-18 h，得粗產(chǎn)物，并以硅膠柱色譜，分別以石油醚-醋酸乙酯（8:1、12:1與15:1）為洗脫劑洗

6、脫，將所得產(chǎn)物經(jīng)FT-IR與1H-NMR鑒定為辛酰半乳糖酯、丁酰半乳糖酯及乙酰半乳糖酯。由于乙酰半乳糖酯純化難度高、副產(chǎn)物多，因此選擇辛酰半乳糖酯與丁酰半乳糖酯用于后續(xù)實驗。
　　2.半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳的制備與表征
　　以薏苡仁油為油相，以薏苡仁多糖水溶液為水相，結(jié)合偽三元相圖，篩選出半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳處方，并對微乳的外觀形態(tài)、平均粒徑、zeta電位等理化參數(shù)進行表征，通過穩(wěn)定性對微乳進行質(zhì)量評價。
　

7、?。?）半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳處方篩選：采用偽三元相圖法，篩選出半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳處方，并采用水滴定法制備微乳：稱取RH40150 mg，PEG40050 mg，半乳糖酯32 mg，磁力攪拌2 h，加入薏苡仁油200 mg，繼續(xù)磁力攪拌2 h，以2 mL薏苡仁多糖水溶液（120 mg/mL）為水相，水滴定法制備辛酰半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳與丁酰半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳（Gal(oct)-C-MEs）與（Gal(but)-

8、C-MEs）。
　　（2）Gal(oct)-C-MEs、Gal(but)-C-MEs理化性質(zhì)表征及質(zhì)量評價：采用動態(tài)光散射法及透射電鏡法對微乳的表面性質(zhì)及形態(tài)學(xué)進行了表征，結(jié)果顯示兩種微乳外觀均澄清透明，Gal(oct)-C-MEs的粒徑、PDI及電位分別為64.32±5.63 nm、0.094±0.006、-0.715±0.230 mV；Gal(but)-C-MEs的粒徑、PDI及電位分別為59.68±6.65 nm、0.070

9、±0.006、-2.950±0.230 mV；透射電鏡觀察顯示所制備的Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs外觀均圓整，分散也較均勻，且所構(gòu)建的微乳在不同稀釋倍數(shù)、高速離心、放置時間、不同pH條件下均保持較強穩(wěn)定性。3.半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳的細胞水平評價
　?。?）Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs對人肝癌HepG2細胞抗增殖作用
　　采用MTT法考察了Gal(oct)-C-

10、MEs與Gal(but)-C-MEs對人肝癌HepG2細胞生長抑制作用。結(jié)果顯示，在薏苡仁油濃度為7.81~250.00μg/mL時，C-MEs、Gal(but)-C-MEs、Gal(oct)-C-MEs對人HepG2細胞增殖均有明顯抑制作用，且與薏苡仁油濃度正相關(guān)。C-MEs、Gal(but)-C-MEs與Gal(oct)-C-MEs的IC50值分別為71.23±6.09、62.55±0.36、47.98±4.00μg/mL。Gal(

11、but)和Gal(oct)修飾使C-MEs的IC50分別降低了1.14倍和1.48倍。
　　（2）HepG2細胞對Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs的攝取研究
　　采用倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀考察了HepG2細胞對Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs的攝取情況。實驗結(jié)果表明，C-MEs、Gal(oct)-C-MEs及Gal(but)-C-MEs組熒光強度顯著強于薏苡仁混合液組，

12、提示薏苡仁組分形成微乳后增強了細胞攝取作用；且經(jīng)半乳糖配體修飾的微乳組Gal(oct)-C-MEs、Gal(but)-C-MEs熒光強度均強于C-MEs，提示C-MEs經(jīng)Gal(oct)、Gal(but)表面修飾后進一步增強了細胞攝取作用。
　　（3）Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用研究
　　采用流式細胞儀考察Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs體外

13、誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用，結(jié)果顯示在不同制劑組作用HepG2細胞12 h后，經(jīng)流式檢測發(fā)現(xiàn)C-MEs、Gal(but)-C-MEs和Gal(oct)-C-MEs均顯著促進細胞凋亡，且Gal(but)-C-MEs、Gal(oct)-C-MEs促進HepG2細胞凋亡能力強于C-MEs；隨著薏苡仁油濃度的增加，促凋亡能力增強。
　　4.半乳糖酯修飾薏苡仁組分微乳體內(nèi)肝腫瘤靶向性、抗腫瘤療效及安全性評價
　　（1）Gal(oct

14、)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs在裸鼠體內(nèi)的分布情況
　　選用HepG2荷瘤裸鼠模型，考察Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs在裸鼠體內(nèi)的分布情況。結(jié)果顯示，薏苡仁組分相關(guān)微乳在肝臟及腫瘤部位吸收分布均明顯改善，甚至在口服給藥48 h后微乳組在腫瘤部位仍有聚集，且Gal(oct)-C-MEs與Gal(but)-C-MEs在腫瘤部位聚集更加顯著，推測可能是靶配體與去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合的結(jié)果。

15、其中Gal(oct)-C-MEs最為顯著，因此后續(xù)實驗選擇肝腫瘤靶向性更好的Gal(oct)-C-MEs進行研究。
　?。?）Gal(oct)-C-MEs的體內(nèi)抗腫瘤藥效
　　選用HepG2荷瘤裸鼠模型，考察Gal(oct)-C-MEs的體內(nèi)抗腫瘤藥效。體內(nèi)抗腫瘤結(jié)果顯示，經(jīng)過Gal(oct)-C-MEs治療后，荷瘤裸鼠相比康萊特注射液（Kanglaite?）、Mixture、C-MEs組，生存時間最長，腫瘤生長抑制最明顯，

16、觀察期結(jié)束后的離體瘤重最輕。體內(nèi)免疫學(xué)初步研究結(jié)果表明，Gal(oct)-C-MEs、Kanglaite?、Mixture、C-MEs組的TNF-α指標(biāo)相對于生理鹽水組均有提高，均具有顯著差異（P<0.05）；表明機體的免疫應(yīng)答致使TNF-α升高起免疫調(diào)節(jié)作用；Gal(oct)-C-MEs、Kanglaite?、Mixture、C-MEs組血清中IL-6的含量與生理鹽水組相比則無明顯變化，具體原因有待進一步探討。
　?。?）Gal

17、(oct)-C-MEs的安全性評價
　　采用全自動生化儀對上述裸鼠肝功能指標(biāo)AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、腎功能指標(biāo)BUN（血尿素氮）進行測定，并采用全自動血液分析儀對裸鼠全血進行血常規(guī)測定。結(jié)果顯示，給藥組裸鼠全血肝功能指標(biāo)ALT、AST及腎功能指標(biāo)與生理鹽水組相比均未出現(xiàn)明顯差異。與生理鹽水組相比較，Gal(oct)-C-MEs、Mixture、C-MEs組WBC明顯升高，與康萊特注射液組比較，Gal(oct)-