靈芝與薏苡仁多糖在口服薏苡仁組分微乳構(gòu)建中的作用及機制探討.pdf

1、中藥植物多糖是從中藥中提取獲得的有一定親水性的大分子聚合物，具有明顯的兩親性和獨特的藥理活性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其能夠參與機體的生理代謝過程，具有增強免疫、抗腫瘤、降血糖等生物活性。同時，其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)與鏈構(gòu)象使得其具有水溶性好、生物粘附強、分子柔性與強度好等優(yōu)點，可以應(yīng)用于藥劑學(xué)領(lǐng)域。然而，目前對中藥植物多糖的研究大多只關(guān)注其藥理活性，其獨特的理化性質(zhì)目前尚未被藥劑學(xué)領(lǐng)域充分關(guān)注。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以靈芝多糖與薏苡仁多糖作為功能性

2、輔料參與構(gòu)建微乳載藥系統(tǒng)，可以增強微乳增溶能力，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。結(jié)合文獻報道，中藥植物多糖作為一種大分子聚合物，存在與藥物晶體氫鍵締合，產(chǎn)生流體界面層，抑制晶體生長;占據(jù)制劑表面吸附部位并形成空間位阻，從而提高制劑的穩(wěn)定性;對制劑進行網(wǎng)格包裹，抑制沉淀等可能性。因此，本文以靈芝多糖與薏苡仁多糖為研究對象，考察了其對薏苡仁油微乳載藥系統(tǒng)構(gòu)建的藥劑與藥效作用，探討了多糖與微乳間的作用機制，為探索中藥植物多糖對微乳等新型載藥系統(tǒng)構(gòu)建的作用

3、，拓寬中藥植物多糖的藥劑學(xué)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.有效組分的提取與純化
　　構(gòu)建微乳脂質(zhì)內(nèi)核的薏苡仁油通過超臨界CO2萃取技術(shù)獲得，薏苡仁油的含量為40.83 mg·g-1生藥，HPLC法測得甘油三油酸酯含量為10.15 mg·g-1生藥，分光光度法測得總甘油三酯的含量為35.39 mg·g-1生藥，薏苡仁油的純度為86.67％（以總甘油三酯計）。
　　采用水提-初級醇沉-精制醇沉-透析法提取并純

4、化了靈芝多糖，經(jīng)參數(shù)優(yōu)選，獲得靈芝多糖水提最佳條件為:料液比1∶10，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為2h;初級醇沉最佳條件為:水提濃縮液濃度2.0 g·mL-1，醇沉濃度為80％，醇沉?xí)r間24 h，醇沉溫度25℃;精制醇沉最佳醇沉濃度為80％;采用截留分子量3000的透析袋透析去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥后得靈芝多糖粉末，分光光度法測得靈芝多糖純度為60.13％（以葡萄糖計）。
　　采用水提-去淀粉-醇沉-去蛋白法提取并純化薏苡仁多糖

5、，對其參數(shù)進行優(yōu)選。獲得薏苡仁多糖水提最佳條件為:料液比1∶12，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為2h;醇沉最佳條件為:水提濃縮液濃度1.0 g·mL-1，醇沉濃度80％，醇沉?xí)r間12h，醇沉溫度25℃;采用Sevag試劑去除蛋白質(zhì)，冷凍干燥后得薏苡仁多糖粉末，分光光度法測得薏苡仁多糖純度為76.63％（以葡萄糖計）。
　　2.靈芝與薏苡仁多糖荷載微乳處方篩選與表征
　　以薏苡仁油為油相，結(jié)合偽三元相圖，水滴定法制備微乳并以微

6、乳區(qū)面積為指標(biāo)，篩選并確定了最佳乳化劑為RH40，助乳化劑為PEG400，Km值為3∶1。固定薏苡仁油用量為400 mg，以微乳粒徑與澄明度為指標(biāo)，確定了乳化劑用量最低為200 mg，PEG400最低用量為67 mg。分別添加靈芝與薏苡仁多糖至薏苡仁油微乳中，考察兩種多糖的乳化劑替代作用，確定靈芝與薏苡仁多糖替代乳化劑RH40最大量為50 mg，最終處方為:薏苡仁油400 mg，RH40150 mg，靈芝或薏苡仁多糖50 mg，PEG4

7、0067 mg。按上述處方制備靈芝多糖荷載微乳與薏苡仁多糖荷載微乳，所得微乳均為澄明溶液，粒徑分別為87.94±3.17與86.07±1.41 nm，PDI分別為0.092±0.033與0.095±0.010，Zeta電位分別為-(12.10±0.70)與-(8.34±0.05) mV。
　　3.靈芝與薏苡仁多糖對微乳理化性質(zhì)的影響
　　考察了靈芝與薏苡仁多糖的加入對薏苡仁油微乳粒徑、電位、形態(tài)及相轉(zhuǎn)變溫度的影響。靈芝與薏苡

8、仁多糖的加入不改變微乳粒徑與形態(tài)，微乳的相轉(zhuǎn)變溫度無明顯變化，但微乳表面負電荷被掩蓋，表面電位升高。穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)微乳本身具有較強的穩(wěn)定性，稀釋、離心、變溫與凍干復(fù)溶下均能維持微乳結(jié)構(gòu)而無分層與絮凝現(xiàn)象出現(xiàn)，靈芝與薏苡仁多糖加入后的微乳仍具有該性質(zhì)。
　　混合制備（多糖與乳化劑、助乳化劑、薏苡仁油混勻后，純化水滴定制備微乳）與滴注共載（乳化劑、助乳化劑、薏苡仁油混勻后，多糖水溶液滴定制備微乳）兩種多糖荷載微乳的制備方法所得微乳的粒

9、徑、電位與相轉(zhuǎn)變溫度無顯著性差異，微乳的形態(tài)一致，且均具有較強的穩(wěn)定性，稀釋、離心、變溫與凍干復(fù)溶后粒徑無顯著性差異，提示這兩種制備方法對多糖荷載微乳的制備無顯著性差異。
　　4.靈芝與薏苡仁多糖對微乳作用機制研究
　　動態(tài)光散射技術(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著靈芝多糖與薏苡仁多糖的濃度提高，微乳表面電位逐漸升高直至維持恒定，提示靈芝多糖、薏苡仁多糖能夠包裹在微乳表面從而掩蓋其表面電荷。
　　為了闡述多糖與微乳間作用機制，采用殼聚糖與葡

10、聚糖這兩種不同單體多糖模擬靈芝多糖與薏苡仁多糖進行本課題研究，其中葡聚糖對微乳表面電位作用與靈芝多糖以及薏苡仁多糖一致。通過化學(xué)方法合成了FITC標(biāo)記的殼聚糖(CSF)與葡聚糖(DTF)，紅外圖譜與核磁氫譜表明殼聚糖與葡聚糖均成功被FITC修飾，其FITC取代度分別為6.25％與7.02％。
　　凝膠滲透實驗發(fā)現(xiàn)，CSF荷載微乳與DTF荷載微乳經(jīng)凝膠柱篩分后，多糖荷載微乳出峰時間提前并且吸光度提高，同時CSF與DTF吸光度降低，提

11、示殼聚糖與葡聚糖及其所模擬的中藥植物多糖可以結(jié)合至微乳體系。
　　熒光能量轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的殼聚糖以及葡聚糖能夠與薏苡仁油微乳脂核內(nèi)的羅丹明123(Rh123)產(chǎn)生熒光能量共振現(xiàn)象，而FITC標(biāo)記的殼聚糖以及葡聚糖與Rh123于溶液中共存無熒光能量共振現(xiàn)象發(fā)生，殼聚糖以及葡聚糖與微乳脂核之間的距離小于10nm，利用公式計算得葡聚糖與微乳臘核間距離為1.70 nm。提示靈芝與薏苡仁多糖可能以部分鏈內(nèi)嵌至微乳內(nèi)核的方式與微乳

12、相互作用并掩蓋其電荷。
　　5.靈芝與薏苡仁多糖對微乳藥效學(xué)影響
　　以A549肺癌細胞為模型考察了靈芝與薏苡仁多糖荷載微乳的體外抗肺癌藥效，薏苡仁油微乳IC50為127μg·mL-1，靈芝多糖荷載微乳為119μg·mL-1，薏苡仁多糖荷載微乳為104μg·mL-1，與薏苡仁油微乳相比，靈芝與薏苡仁多糖的加入降低了IC50，提高了體外抗肺癌藥效。以Caco-2為細胞模型的腸道毒性實驗發(fā)現(xiàn)，與薏苡仁油微乳相比，Caco-2細胞

13、孵育后，靈芝與薏苡仁多糖荷載微乳的細胞毒性小于薏苡仁油微乳。體內(nèi)抗腫瘤實驗表明，與生理鹽水組相比，多糖荷載微乳組腫瘤重量與腫瘤體積顯著降低，靈芝多糖荷載微乳的抑瘤率為52.06％，薏苡仁多糖荷載微乳的抑瘤率為44.13％，靈芝多糖荷載微乳的抗肺癌藥效與已上市康萊特注射液(58.75％)相當(dāng)。組織分布實驗表明，靈芝與薏苡仁多糖對微乳體內(nèi)腸道滯留性有明顯提高，給藥后腫瘤部位明顯蓄積。
　　本研究以靈芝多糖與薏苡仁多糖為研究對象探求了中