丹參酮ⅡA對(duì)大鼠急性脊髓損傷保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過研究丹參酮ⅡA聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍對(duì)ASCI后脊髓組織及神經(jīng)元的保護(hù)作用，探討丹參酮ⅡA能否替代或部分替代甲基強(qiáng)的松龍治療ASCI，達(dá)到減少甲基強(qiáng)的松龍的用量，而又能獲得相似的神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)通過研究丹參酮ⅡA對(duì) ASCI后軸突再生過程中相關(guān)抑制信號(hào)通路RhoA/ROCKII/MLC的影響，從傳統(tǒng)中藥中尋促進(jìn)ASCI后軸突再生的有效成分。
　　方法：
　　第一部分：大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓神經(jīng)元分層共培

2、養(yǎng)體系的建立，通過分層培養(yǎng)的方法建立大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，經(jīng)免疫熒光染色鑒定，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分：丹參酮ⅡA聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠ASCI后脊髓組織的保護(hù)作用
　　1、MTT法檢測丹參酮ⅡA最適神經(jīng)元培養(yǎng)濃度；建立體外脊髓神經(jīng)元損傷模型；實(shí)驗(yàn)分組，Sham組：空白對(duì)照組，神經(jīng)元正常培養(yǎng)；ASCI組：損傷對(duì)照組，神經(jīng)元做損傷模型，神經(jīng)元正常培養(yǎng)；TⅡA組：制成神經(jīng)元損傷模型，加含10μM丹

3、參酮ⅡA的神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng)；MP組：制成神經(jīng)元損傷模型，加含1μM甲基強(qiáng)的松龍的神經(jīng)元培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；TⅡA+MP組：制成神經(jīng)元損傷模型，加含10μM丹參酮IIA和0.5μM甲基強(qiáng)的松龍的神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行分析。24h后Western Blot法檢測神經(jīng)元內(nèi)Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)。
　　2、Allen打擊法建立體內(nèi)大鼠T9節(jié)段脊髓急性脊傷模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將造模成功的60只

4、SD大鼠分為5組，Sham組：空白對(duì)照組，作T9椎板切除，不作急性脊髓損傷打擊模型，正常飼養(yǎng)；ASCI組：損傷對(duì)照組，作T9椎板切除，并作急性脊髓損傷打擊模型，正常飼養(yǎng)；TⅡA組：作T9椎板切除，并作急性脊髓損傷打擊模型，給予丹參酮IIA30mg/kg/d藥物治療；MP組：作T9椎板切除，并作急性脊髓損傷打擊模型，給予甲基強(qiáng)的松龍30mg/kg藥物治療；TⅡA+MP組：作T9椎板切除，并急性脊髓損傷作打擊模型，給予丹參酮IIA30mg/

5、kg/d和甲基強(qiáng)的松龍20mg/kg藥物治療。BBB評(píng)分法評(píng)估大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。第1天RT-PCR法檢測脊髓組織內(nèi)Caspase-3 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)， Western Blot法檢測各組第1天脊髓組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)和第7天脊髓組織內(nèi)Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量。第1、7天檢測大鼠脊髓組織中SOD活性和MDA的含量，第3天用免疫熒光雙標(biāo)法檢測大鼠脊髓組織神經(jīng)元內(nèi)Caspase-3的表達(dá)

6、量。
　　第三部分丹參酮ⅡA對(duì)大鼠ASCI后RhoA/ROCKⅡ/MLC信號(hào)通路表達(dá)的影響
　　1、大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立及損傷模型同第二部分，實(shí)驗(yàn)分組，Sham組：空白對(duì)照組，神經(jīng)元正常培養(yǎng)；ASCI組：損傷對(duì)照組，神經(jīng)元做損傷模型，神經(jīng)元正常培養(yǎng)； TⅡA組：制成神經(jīng)元損傷模型，加含10μM丹參酮 ⅡA的神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng)；Fasudil組：制成神經(jīng)元損傷模型，加含10μM法舒地爾的神經(jīng)元培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)

7、胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行分析。細(xì)胞損傷后24h RT-PCR法檢測神經(jīng)元內(nèi)RhoA mRNA和ROCKII mRNA表達(dá)量，Western Blot法檢測神經(jīng)元內(nèi)RhoA、ROCKⅡ、MLC和p-MLC的表達(dá)。
　　2、建立大鼠急性脊髓損傷模型同第二部分，實(shí)驗(yàn)分組，Sham組：空白對(duì)照組，作T9椎板切除，正常飼養(yǎng)；ASCI組：損傷對(duì)照組，作T9椎板切除，并作急性脊髓損傷打擊模型，正常飼養(yǎng)。TⅡA組：作T9椎板切除，并

8、作急性脊髓損傷打擊模型，給以丹參酮IIA30mg/kg/d藥物治療。Fasudil組：作T9椎板切除，并作急性脊髓損傷打擊模型，給予法舒地爾10mg/kg/d藥物治療。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，于術(shù)后1天和7天各組取4只大鼠處死取材用于檢測各項(xiàng)指標(biāo)。BBB評(píng)分法評(píng)估大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能。大鼠ASCI后第1天RT-PCR法檢測大鼠脊髓組織內(nèi)RhoA mRNA和ROCKⅡ mRNA表達(dá)水平，術(shù)后第1、7天Western Blot法檢測RhoA、ROCKⅡ、

9、MLC和p-MLC的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞接種后4h后顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞貼壁，胞體為圓形，透光性強(qiáng)，未見明顯的突起伸出。24小時(shí)后可見星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁，位于培養(yǎng)瓶的底層，胞體扁平，呈三角形、菱形或者多邊形，部分細(xì)胞伸出多個(gè)粗短的突起，7-9天時(shí)可見細(xì)胞間相互融合約70％-80%時(shí)，可以進(jìn)行傳代；
　　1.2傳代的星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁較快，接種后1-2小時(shí)大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁

10、，第二天可見胞體變大，形態(tài)不規(guī)則；傳代培養(yǎng)4-5天后細(xì)胞貼壁緊密，胞體呈布?jí)K狀貼壁，相互之間接觸。
　　1.3原代脊髓神經(jīng)元接種后4h后顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞貼壁，胞體為圓形，透光性強(qiáng)，未見明顯的突起伸出。第二天換液可見多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞貼壁。
　　第二部分：2.1損傷后各組大鼠BBB評(píng)分均為0分。大鼠脊髓損傷后第1、2天，MP組的SD大鼠BBB評(píng)分顯著高于TⅡA組（P<0.05），與TⅡA+MP組無顯著性差異（P>0.05）

11、。第5至7天，TⅡA組和TⅡA+MP組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分高于MP組（P<0.05）。
　　2.2大鼠脊髓損傷后第1天，ASCI組大鼠的脊髓組織內(nèi) Caspase-3 mRNA和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯高于其余各組(P<0.05)。TⅡA+MP組大鼠脊髓內(nèi)Caspase-3 mRNA和NF-κB mRNA表達(dá)水平較MP組無顯著升高(P>0.05)。
　　2.3大鼠脊髓損傷后第7天，MP組和TIIA+MP組大鼠脊髓組

12、織內(nèi)的Bax和Caspase-3表達(dá)水平較ASCI組顯著降低(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。TⅡA組的 Bcl-2表達(dá)量與 ASCI組沒有顯著差異(P>0.05)，Bax和 Caspase-3表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。TⅡA組和 MP組大鼠的脊髓組織內(nèi)的Bax和Caspase-3表達(dá)水平較TⅡA+MP組顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。
　　在脊髓神經(jīng)元內(nèi)，

13、ASCI組大鼠脊髓神經(jīng)元Bax和Caspase-3表達(dá)水平較其余各組明顯升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。MP組神經(jīng)元內(nèi)Caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá)水平較TⅡA+MP組無顯著差異(P>0.05)。TⅡA組脊髓神經(jīng)元內(nèi) Bcl-2表達(dá)水平顯著低于 TⅡA+MP組(P<0.05)，而兩組Caspase-3和Bax的表達(dá)水平則無顯著差異(P>0.05)。
　　與 ASCI組比較，所有藥物治療

14、組大鼠脊髓組織內(nèi)和神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2/Bax明顯升高(P<0.05)， TⅡA組大鼠脊髓組織內(nèi)和神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2/Bax比值顯著低于MP組和TⅡA+MP組(P<0.05)。TⅡA+MP組與MP組Bcl-2/Bax比值無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.4大鼠脊髓損傷后第1天和第7天，MP組大鼠脊髓組織內(nèi)SOD含量較ASCI組顯著升高（P<0.05），而MDA的含量則顯著降低（P<0.05）。TIIA+MP組大鼠脊髓組織內(nèi)MD

15、A的含量較TIIA組顯著降低（P<0.05），而 SOD的含量較 TIIA組無顯著差別（P>0.05）。MP組大鼠脊髓組織內(nèi)SOD和MDA的含量和TIIA+MP組無顯著差異（P>0.05）。
　　2.5大鼠脊髓損傷后第1天，ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平較其它組顯著升高（P<0.05）。TIIA+MP組的脊髓組織內(nèi)NF-κB水平低于MP組，但無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.6根據(jù)MTT檢測結(jié)果，選擇10

16、μM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳的丹參酮IIA濃度來培養(yǎng)神經(jīng)元。在ASCI組神經(jīng)元在機(jī)械性損傷后24小時(shí)OD值較其他組顯著下降(P<0.05)。TⅡA+MP組神經(jīng)元的活力是高于 MP組，但無顯著差異(P>0.05)。
　　2.7大鼠脊髓損傷后第3天免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，TⅡA組大鼠脊髓組織內(nèi) Caspase-3的表達(dá)量較 ASCI組無顯著差異（P>0.05），MP組和 TⅡA+MP組脊髓組織內(nèi) Caspase-3的表達(dá)量較 ASCI組

17、顯著降低(P<0.05)，MP組脊髓組織內(nèi)Caspase-3的表達(dá)量較TⅡA+MP組無顯著差異（P>0.05）。
　　第三部分：
　　3.1 TⅡA組和Fasudil組的大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分無顯著性差異（P>0.05）。第2天至第7天，TⅡA組和Fasudil組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著高于ASCI組（P<0.05）。
　　3.2 ASCI組脊髓神經(jīng)元內(nèi)的RhoA和ROCKⅡ表達(dá)水平明顯較其它組顯著上升(P<0.

18、05)。Fasudil組脊髓神經(jīng)元內(nèi)ROCKII表達(dá)量較TIIA組大鼠的脊髓組織內(nèi)的ROCKⅡ表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，而RhoA的表達(dá)量較TIIA組顯著減少(P<0.05)。
　　大鼠脊髓損傷后第1天和第7天， ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)RhoA和ROCKⅡ的表達(dá)水平較其它組顯著升高(P<0.05)。大鼠脊髓損傷后第1天， Fasudil組大鼠脊髓組織內(nèi) RhoA和 ROCKII表達(dá)量較 TⅡA組顯著升高（P<0.05）

19、。大鼠脊髓損傷后第7天時(shí)，TⅡA組大鼠的脊髓組織內(nèi)的RhoA和ROCKII表達(dá)水平較Fasudil組顯著升高（P<0.05）。
　　3.3大鼠脊髓損傷后第1天，ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)RhoA mRNA和ROCKII mRNA的表達(dá)量較其它組顯著升高（P<0.05）。Fasudil組RhoA mRNA和ROCKⅡ mRNA的表達(dá)量較TIIA組顯著降低（P<0.05）。在機(jī)械損傷的脊髓神經(jīng)元內(nèi)，ASCI組神經(jīng)元內(nèi)RhoA mRNA和

20、ROCKⅡ mRNA的表達(dá)量較其它組顯著升高（P<0.05）。Fasudil組RhoA mRNA和ROCKII mRNA的表達(dá)量較TⅡA組低，但無顯著性差異（P>0.05）。
　　3.4在脊髓神經(jīng)元中，ASCI組脊髓神經(jīng)元內(nèi)MLC表達(dá)量較其它組無顯著差異（P>0.05），p-MLC表達(dá)量較其它組顯著升高（P<0.05）；TIIA組脊髓神經(jīng)元內(nèi)p-MLC表達(dá)較Fasudil組低，但無顯著性差異（P>0.05）；在各組脊髓神經(jīng)元內(nèi)，A

21、SCI組脊髓神經(jīng)元內(nèi)p-MLC/MLC比值較其它組顯著升高（P<0.05）； TIIA組脊髓神經(jīng)元內(nèi) p-MLC/MLC的比值較與Fasudil組顯著降低（P<0.05）。
　　大鼠脊髓損傷后第1天， ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)MLC表達(dá)量與其它組無顯著差異（P>0.05），p-MLC表達(dá)量較其它組顯著升高（P<0.05）；TⅡA組大鼠脊髓組織內(nèi) p-MLC表達(dá)較 Fasudil組低，但無顯著性差異（P>0.05）；各組大鼠脊髓組織

22、內(nèi)， ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)p-MLC/MLC比值較其它組顯著升高（P<0.05）；TⅡA組大鼠脊髓組織內(nèi) p-MLC/MLC的比值較Fasudil組低，但無顯著性差異（P>0.05）。
　　大鼠脊髓損傷后第7天，ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)MLC表達(dá)量較其它組無顯著差異（P>0.05），p-MLC表達(dá)量較其它組顯著升高（P<0.05）；TIIA組大鼠脊髓組織內(nèi)p-MLC表達(dá)量量較Fasudil組顯著升高（P<0.05）。各組大鼠脊

23、髓組織內(nèi)， ASCI組大鼠脊髓組織內(nèi)p-MLC/MLC比值較其它組顯著升高（P<0.05）；TⅡA組大鼠脊髓組織內(nèi)p-MLC/MLC比值較Fasudil組顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1.根據(jù)免疫組織鑒定結(jié)果，我們獲得了星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分層共培養(yǎng)體系，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.同甲基強(qiáng)的松龍治療作用相似，丹參酮ⅡA可以通過其抗氧化、抑制炎性相關(guān)因子分泌和抗凋亡等藥理作用來發(fā)揮對(duì)ASCI后脊髓組織保