TERT啟動(dòng)子突變在膠質(zhì)瘤中的分布以及預(yù)后分層研究.pdf

1、端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一段序列，隨著細(xì)胞的分裂而逐漸縮短。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)通過激活端粒酶來保持端粒的完整，使細(xì)胞獲得無限增殖能力。TERT在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)，并與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，而正常腦組織中則沒有TERT的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子區(qū)域存在兩個(gè)體細(xì)胞突變:C228T和C250T，并導(dǎo)致TERT啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性增加了2-4倍。國外有報(bào)道發(fā)現(xiàn)

2、TERT啟動(dòng)子突變在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中頻繁出現(xiàn)，并對(duì)預(yù)后產(chǎn)生一定的影響。本研究希望通過基于中國人群的大樣本中進(jìn)行TERT啟動(dòng)子突變的檢測，明確其分布規(guī)律和對(duì)于預(yù)后的影響，希望能夠找到一個(gè)具有預(yù)后判斷價(jià)值的分子標(biāo)志物。
　　在本課題的第一部分中，我們對(duì)887例不同級(jí)別、不同組織病理學(xué)亞型的膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行全基因組DNA的提取，通過巢式PCR擴(kuò)增含有TERT啟動(dòng)子突變的特定區(qū)域，割膠回收純化后進(jìn)行Sanger測序，通過比對(duì)分析擴(kuò)增片段中C2

3、28T和C250T突變情況，統(tǒng)計(jì)突變率，繪制C228T和C250T突變在不同級(jí)別，不同組織學(xué)亞型的膠質(zhì)瘤中的分布譜，并揭示其富集規(guī)律。結(jié)果顯示:在887例膠質(zhì)瘤樣本的TERT啟動(dòng)子區(qū)域上，274例被檢測出含有C228T突變，占到總樣本數(shù)的30.89％，83例含有C250T突變，占到總樣本數(shù)的9.36％。僅有1例樣本同時(shí)存在C228T和C250T雙位點(diǎn)的突變。除10例為純合子突變外，其余所有含有突變點(diǎn)的樣本均為雜合突變。我們按照2007年

4、WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)分析了TERT在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的分布規(guī)律。結(jié)果顯示，在498例WHOⅡ級(jí)膠質(zhì)瘤樣本中，有197例被檢測出含有TERT突變，突變率為39.56％;在139例WHOⅢ級(jí)膠質(zhì)瘤樣本中，有56例被檢測出含有TERT突變，突變率為40.29％;在250例WHOⅣ級(jí)膠質(zhì)瘤樣本中，有104例被檢測出含有TERT突變，突變率為41.6％。突變率隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高略有增加。我們隨后在各組織學(xué)亞型中統(tǒng)計(jì)了TERT啟動(dòng)子的分布規(guī)

5、律:其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中TERT啟動(dòng)子突變的富集比例最高，占到75.71％(53/70)，星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤中TERT啟動(dòng)子的突變頻率最低，僅有10.84％(22/203)。為了更詳細(xì)的描述TERT啟動(dòng)子突變在膠質(zhì)母細(xì)胞中的分布，我們分別在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中分析TERT的突變頻率，結(jié)果顯示44.72％(89/199)的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤含有TERT啟動(dòng)子突變，而只有29.41％(15/51)的繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤含有此突

6、變。通過上述結(jié)果我們認(rèn)為TERT啟動(dòng)子突變在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中高度富集，突變率隨腫瘤級(jí)別的增加有遞增趨勢，且C228T突變和C250T突變呈明顯的互斥現(xiàn)象。TERT啟動(dòng)子突變在以中國人群為基礎(chǔ)的膠質(zhì)瘤患者中穩(wěn)定存在，可以作為針對(duì)中國人群的膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)后分層研究。
　　目前膠質(zhì)瘤治療所面臨的問題主要有以下幾個(gè)方面:膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性和浸潤性較強(qiáng)，這在一定程度上限制了手術(shù)切除的范圍;在化學(xué)治療后很快就會(huì)出現(xiàn)具有抗藥性的細(xì)胞克隆

7、;腫瘤細(xì)胞中存在多種致癌信號(hào)通路的激活和基因突變體的相互作用等等。鑒于上述原因，膠質(zhì)瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存率一直很低，其中位生存期一般不超過15個(gè)月。然而，仍有不足10％的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的壽命可以延長到三至五年。但是這部分患者生存期延長的原因和他們本身體質(zhì)以及基因改變之間的原因仍未能明確。有報(bào)道指出:攜帶O6-Methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT)啟動(dòng)子甲基化的年輕女性膠質(zhì)瘤患者有

8、機(jī)會(huì)獲得比其他患者更長的生存期。因此，尋找具有診斷或者預(yù)后意義的特征性分子標(biāo)志物，并進(jìn)行相關(guān)的預(yù)后分層研究對(duì)膠質(zhì)瘤的個(gè)體化治療具有重要的指導(dǎo)意義。
　　因此在本課題的第二部分中，我們針對(duì)不同級(jí)別，不同組織學(xué)亞新的膠質(zhì)瘤進(jìn)行TERT啟動(dòng)子突變的預(yù)后分層研究，并通過全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)對(duì)膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行TCGA分型注釋，并在Proneural，Neural，Classical，Mesenchymal四個(gè)分子亞型中評(píng)估TERT啟動(dòng)子突變的預(yù)后

9、判斷價(jià)值。結(jié)果顯示:TERT啟動(dòng)子突變組的患者生存期明顯長于TERT啟動(dòng)子野生組的生存期(P＜0.05)，且C250T突變組的患者生存期長于C228T突變組的生存期。在WHOⅡ級(jí)膠質(zhì)瘤中，TERT啟動(dòng)子突變組的患者生存期的優(yōu)勢則更加明顯。當(dāng)采用TCGA分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行分子亞型注釋后我們發(fā)現(xiàn)，TERT啟動(dòng)子突變在Proneural和Mesenchymal兩個(gè)分子亞型中呈現(xiàn)出了明顯的預(yù)后分層，而在Classical和Neural兩個(gè)亞型中

10、的分層并不明顯。據(jù)此我們得出結(jié)論:TERT啟動(dòng)子突變作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后指標(biāo)的分子標(biāo)志物在TCGA亞型和低級(jí)別膠質(zhì)瘤中的預(yù)測意義較為明顯，可以作為一個(gè)穩(wěn)定的預(yù)后指標(biāo)為這類膠質(zhì)瘤患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。
　　近年來的研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤在其發(fā)生發(fā)展的過程中存在著不同的遺傳背景，這些遺傳背景始終貫穿著一個(gè)或幾個(gè)特征性的基因改變。而這些特征性的基因改變也直接或間接的影響著膠質(zhì)瘤的演化和預(yù)后。目前公認(rèn)的是IDH突變是膠質(zhì)瘤發(fā)生基因組改變的早期事件，而T

11、P53突變和1P19Q缺失則分別出現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的進(jìn)化過程中。其中TP53突變更被認(rèn)為是從低級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化為繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的過程中攜帶的遺傳標(biāo)志物。而EGFR擴(kuò)增則是原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的特征性遺傳標(biāo)志物。
　　在第三部分的研究中，我們引入目前已知的與膠質(zhì)瘤預(yù)后密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，包括IDH突變、1P19Q缺失、TP53突變，PTEN突變、EGFR擴(kuò)增和MGMT啟動(dòng)子甲基化等，進(jìn)一步分析了TERT突

12、變在這些特征性基因變異的情況下對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后影響。結(jié)果顯示:在1P19Q缺失和IDH1突變的環(huán)境中，TERT啟動(dòng)子突變的預(yù)后優(yōu)勢更加明顯。此外，在針對(duì)PTEN突變和EGFR擴(kuò)增的聯(lián)合分析中我們發(fā)現(xiàn)，只有在不攜帶這兩種分子標(biāo)志物的前提下，TERT啟動(dòng)子突變才可作為預(yù)后較好的分子標(biāo)志物而存在。PTEN突變和EGFR擴(kuò)增對(duì)TERT啟動(dòng)子突變的預(yù)后均存在抑制作用，這種抑制效應(yīng)在TP53突變組中更加明顯。
　　綜上所述，本課題通過巢式P

13、CR、Sanger測序、全轉(zhuǎn)錄子測序、mRNA芯片數(shù)據(jù)、生存預(yù)后統(tǒng)計(jì)等方法，對(duì)膠質(zhì)瘤中TERT啟動(dòng)子突變，TP53突變、IDH突變、1P19Q缺失、PTEN突變和EGFR擴(kuò)增等分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測，繪制TERT啟動(dòng)子突變在膠質(zhì)瘤中的富集譜，綜合評(píng)估了TERT啟動(dòng)子突變作為特征性分子標(biāo)志物在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價(jià)值。這些結(jié)果為后續(xù)深入研究TERT啟動(dòng)子突變影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為尋找膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物及分子治療的靶點(diǎn)篩選