TERT啟動子突變在膠質瘤中的分布以及預后分層研究.pdf

1、端粒是真核細胞染色體末端的一段序列，隨著細胞的分裂而逐漸縮短。端粒酶逆轉錄酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)通過激活端粒酶來保持端粒的完整，使細胞獲得無限增殖能力。TERT在膠質瘤細胞中存在高表達，并與膠質瘤的惡性程度密切相關，而正常腦組織中則沒有TERT的表達。研究發(fā)現(xiàn)TERT啟動子區(qū)域存在兩個體細胞突變:C228T和C250T，并導致TERT啟動子的轉錄活性增加了2-4倍。國外有報道發(fā)現(xiàn)

2、TERT啟動子突變在膠質母細胞瘤中頻繁出現(xiàn)，并對預后產(chǎn)生一定的影響。本研究希望通過基于中國人群的大樣本中進行TERT啟動子突變的檢測，明確其分布規(guī)律和對于預后的影響，希望能夠找到一個具有預后判斷價值的分子標志物。
　　在本課題的第一部分中，我們對887例不同級別、不同組織病理學亞型的膠質瘤樣本進行全基因組DNA的提取，通過巢式PCR擴增含有TERT啟動子突變的特定區(qū)域，割膠回收純化后進行Sanger測序，通過比對分析擴增片段中C2

3、28T和C250T突變情況，統(tǒng)計突變率，繪制C228T和C250T突變在不同級別，不同組織學亞型的膠質瘤中的分布譜，并揭示其富集規(guī)律。結果顯示:在887例膠質瘤樣本的TERT啟動子區(qū)域上，274例被檢測出含有C228T突變，占到總樣本數(shù)的30.89％，83例含有C250T突變，占到總樣本數(shù)的9.36％。僅有1例樣本同時存在C228T和C250T雙位點的突變。除10例為純合子突變外，其余所有含有突變點的樣本均為雜合突變。我們按照2007年

4、WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級分析了TERT在不同級別膠質瘤中的分布規(guī)律。結果顯示，在498例WHOⅡ級膠質瘤樣本中，有197例被檢測出含有TERT突變，突變率為39.56％;在139例WHOⅢ級膠質瘤樣本中，有56例被檢測出含有TERT突變，突變率為40.29％;在250例WHOⅣ級膠質瘤樣本中，有104例被檢測出含有TERT突變，突變率為41.6％。突變率隨著膠質瘤級別的升高略有增加。我們隨后在各組織學亞型中統(tǒng)計了TERT啟動子的分布規(guī)

5、律:其中少突膠質細胞瘤中TERT啟動子突變的富集比例最高，占到75.71％(53/70)，星型膠質細胞瘤中TERT啟動子的突變頻率最低，僅有10.84％(22/203)。為了更詳細的描述TERT啟動子突變在膠質母細胞中的分布，我們分別在原發(fā)性膠質母細胞瘤和繼發(fā)性膠質母細胞瘤中分析TERT的突變頻率，結果顯示44.72％(89/199)的原發(fā)性膠質母細胞瘤含有TERT啟動子突變，而只有29.41％(15/51)的繼發(fā)性膠質母細胞瘤含有此突

6、變。通過上述結果我們認為TERT啟動子突變在少突膠質細胞瘤中高度富集，突變率隨腫瘤級別的增加有遞增趨勢，且C228T突變和C250T突變呈明顯的互斥現(xiàn)象。TERT啟動子突變在以中國人群為基礎的膠質瘤患者中穩(wěn)定存在，可以作為針對中國人群的膠質瘤分子標志物進行預后分層研究。
　　目前膠質瘤治療所面臨的問題主要有以下幾個方面:膠質瘤細胞的侵襲性和浸潤性較強，這在一定程度上限制了手術切除的范圍;在化學治療后很快就會出現(xiàn)具有抗藥性的細胞克隆

7、;腫瘤細胞中存在多種致癌信號通路的激活和基因突變體的相互作用等等。鑒于上述原因，膠質瘤，特別是膠質母細胞瘤患者的生存率一直很低，其中位生存期一般不超過15個月。然而，仍有不足10％的膠質母細胞瘤患者的壽命可以延長到三至五年。但是這部分患者生存期延長的原因和他們本身體質以及基因改變之間的原因仍未能明確。有報道指出:攜帶O6-Methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT)啟動子甲基化的年輕女性膠質瘤患者有

8、機會獲得比其他患者更長的生存期。因此，尋找具有診斷或者預后意義的特征性分子標志物，并進行相關的預后分層研究對膠質瘤的個體化治療具有重要的指導意義。
　　因此在本課題的第二部分中，我們針對不同級別，不同組織學亞新的膠質瘤進行TERT啟動子突變的預后分層研究，并通過全轉錄組測序數(shù)據(jù)對膠質瘤樣本進行TCGA分型注釋，并在Proneural，Neural，Classical，Mesenchymal四個分子亞型中評估TERT啟動子突變的預后

9、判斷價值。結果顯示:TERT啟動子突變組的患者生存期明顯長于TERT啟動子野生組的生存期(P＜0.05)，且C250T突變組的患者生存期長于C228T突變組的生存期。在WHOⅡ級膠質瘤中，TERT啟動子突變組的患者生存期的優(yōu)勢則更加明顯。當采用TCGA分型標準對樣本進行分子亞型注釋后我們發(fā)現(xiàn)，TERT啟動子突變在Proneural和Mesenchymal兩個分子亞型中呈現(xiàn)出了明顯的預后分層，而在Classical和Neural兩個亞型中

10、的分層并不明顯。據(jù)此我們得出結論:TERT啟動子突變作為判斷膠質瘤預后指標的分子標志物在TCGA亞型和低級別膠質瘤中的預測意義較為明顯，可以作為一個穩(wěn)定的預后指標為這類膠質瘤患者預后進行評估。
　　近年來的研究發(fā)現(xiàn)膠質瘤在其發(fā)生發(fā)展的過程中存在著不同的遺傳背景，這些遺傳背景始終貫穿著一個或幾個特征性的基因改變。而這些特征性的基因改變也直接或間接的影響著膠質瘤的演化和預后。目前公認的是IDH突變是膠質瘤發(fā)生基因組改變的早期事件，而T

11、P53突變和1P19Q缺失則分別出現(xiàn)在星形膠質細胞瘤和少突膠質細胞瘤的進化過程中。其中TP53突變更被認為是從低級別星形膠質細胞瘤轉化為繼發(fā)性膠質母細胞瘤的過程中攜帶的遺傳標志物。而EGFR擴增則是原發(fā)性膠質母細胞瘤的特征性遺傳標志物。
　　在第三部分的研究中，我們引入目前已知的與膠質瘤預后密切相關的分子標志物，包括IDH突變、1P19Q缺失、TP53突變，PTEN突變、EGFR擴增和MGMT啟動子甲基化等，進一步分析了TERT突

12、變在這些特征性基因變異的情況下對膠質瘤患者的預后影響。結果顯示:在1P19Q缺失和IDH1突變的環(huán)境中，TERT啟動子突變的預后優(yōu)勢更加明顯。此外，在針對PTEN突變和EGFR擴增的聯(lián)合分析中我們發(fā)現(xiàn)，只有在不攜帶這兩種分子標志物的前提下，TERT啟動子突變才可作為預后較好的分子標志物而存在。PTEN突變和EGFR擴增對TERT啟動子突變的預后均存在抑制作用，這種抑制效應在TP53突變組中更加明顯。
　　綜上所述，本課題通過巢式P

13、CR、Sanger測序、全轉錄子測序、mRNA芯片數(shù)據(jù)、生存預后統(tǒng)計等方法，對膠質瘤中TERT啟動子突變，TP53突變、IDH突變、1P19Q缺失、PTEN突變和EGFR擴增等分子標志物進行檢測，繪制TERT啟動子突變在膠質瘤中的富集譜，綜合評估了TERT啟動子突變作為特征性分子標志物在膠質瘤中的預后價值。這些結果為后續(xù)深入研究TERT啟動子突變影響膠質瘤預后的機制奠定了基礎，也為尋找膠質瘤診斷和預后相關的分子標志物及分子治療的靶點篩選