大黃酸調(diào)控Rac1-LIMK1-Cofilin通路與抑制卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究.pdf

1、目的：通過觀察大黃酸對人卵巢癌細(xì)胞淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移能力的亞克隆細(xì)胞（SKOV3-pm4）的運動遷移能力的抑制作用與其對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，探討大黃酸對卵巢癌SKOV3-pm4細(xì)胞Rac1活性蛋白和Rac1/LIMK1/Cofilin信號通路中關(guān)鍵蛋白分子表達(dá)的影響。明確大黃酸對卵巢癌細(xì)胞Rac1蛋白的靶向作用，為研究干預(yù)卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵襲的提供新途徑。
　　方法：利用MTT法檢測不同濃度大黃酸處理卵巢癌SKOV3-pm4細(xì)胞的增殖作

2、用，Transwell小室侵襲實驗測定細(xì)胞的侵襲能力。采用掃描電子顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡觀察不同時間和不同大黃酸濃度處理后細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞骨架的改變。選擇PMA為Rac1激活劑，NSC23766為Rac1抑制劑，分別采用Rac1 Pull-down Assay和Western Blot實驗方法檢測大黃酸聯(lián)合抑制劑或激活劑對卵巢癌細(xì)胞SKOV3-pm4的Rac1-GTPase活性蛋白與Rac1總蛋白的影響。采用實時熒光定量P

3、CR(qRT-PCR)和Western Blot實驗方法檢測大黃酸聯(lián)合Rac1抑制劑和激活劑對卵巢癌SKOV3-pm4細(xì)胞的Rac1/LIMK1/Cofilin信號通路及Rac1/IRSp53/WAVE2/Arp2信號通路關(guān)鍵分子的基因與蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：大黃酸能抑制SKOV3-pm4細(xì)胞的增殖能力，24h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為121.24μmol·L-1。與空白對照組相比，大黃酸能抑制SKOV3-pm4細(xì)胞增殖和

4、侵襲能力（P<0.05），濃度為26.40μmol·L-1的大黃酸處理12h后，細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)出現(xiàn)偽足減少、微絲斷裂與分布紊亂，質(zhì)膜凹凸不平、褶皺凸起減少，細(xì)胞間的間隙變寬等超微結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞體外遷移和侵襲能力均降低。Rac1 Pull-down Assay與Western Blot實驗顯示：大黃酸可下調(diào)Rac1總蛋白與Rac1-GTPase活性蛋白表達(dá)，且存在濃度依賴性；Rac1抑制劑NSC23766聯(lián)合大黃酸作用，與單獨使用Rac1

5、抑制劑組比較，卵巢癌細(xì)胞的Rac1總蛋白與Rac1-GTPase活性蛋白均明顯降低（P<0.05）；Rac1激活劑PMA的作用下，Rac1總蛋白與Rac1-GTPase活性蛋白的表達(dá)均升高；而激活劑聯(lián)合大黃酸作用后Rac1總蛋白與Rac1-GTPase活性蛋白比單用Rac1激活劑PMA組表達(dá)降低（P<0.05）。qRT-PCR和Western Blot實驗顯示：Rac1/LIMK1/Cofilin分子信號通路中，大黃酸、大黃酸聯(lián)合Rac

6、1抑制劑和Rac1激活劑聯(lián)合大黃酸作用后，與空白組、單用Rac1抑制劑、單用Rac1激活劑比較，Rac1、PAK1、LIMK1和cofilin mRNA表達(dá)降低（P<0.05），Rac1、P-PAK1、P-LIMK1和P-cofilin蛋白水平也降低（P<0.05），但PAK1、LIMK1和cofilin的總蛋白沒有明顯變化；同樣，Rac1/IRSp53/WAVE2/Arp2分子信號通路：對于大黃酸、大黃酸聯(lián)合Rac1抑制劑和Rac1激

7、活劑，與空白組、單用Rac1抑制劑、單用Rac1激活劑比較，IRSp53、WAVE2和Arp2 mRNA表達(dá)降低（P<0.05），IRSp53、WAVE2和Arp2蛋白水平也降低（P<0.05），不同濃度大黃酸對上述通路蛋白表達(dá)均具有抑制作用，且呈濃度依賴性。
　　結(jié)論：大黃酸抑制具有淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其抑制作用與卵巢癌細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。大黃酸對卵巢癌細(xì)胞Rac1總蛋白與Rac1-GT