Rictor在卵巢癌腹腔侵襲轉移的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Rictor促進卵巢癌腹腔侵襲轉移的研究
　　目的：研究雷帕霉素靶蛋白復合體2重要組成部分Rictor蛋白在調節(jié)卵巢癌腹腔轉移方面的作用及具體機制。
　　方法：免疫組織化學法檢測Rictor在不同組織分型卵巢癌組織標本及配對漿液性卵巢癌原位灶與轉移灶中的表達情況；建立并鑒定腹腔高轉卵巢癌細胞株；表達譜芯片確定高轉細胞株活化通路；轉染慢病毒表達的Rictor shRNA，穩(wěn)

2、定下調Rictor表達，通過Western blot、免疫熒光鑒定Rictor對卵巢癌細胞系上皮間質化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響；Transwell實驗鑒定Rictor下調后卵巢癌細胞體外轉移能力影響；斑馬魚轉移模型鑒定Rictor下調后，卵巢癌細胞體內實驗轉移能力的影響；實時定量PCR、Western blot鑒定Rictor下調后經典EMT相關轉錄因子變化；通過已有公開的臨床

3、卵巢癌病人表達譜數據確定Zeb1與Rictor相關性；Rictor下調后通過轉染Zeb1質粒，Western blot檢測Zeb1對Rictor介導的EMT相關蛋白的影響，并用Transwell實驗檢測對卵巢癌細胞體外侵襲能力的影響；通過建立Nod/Scid卵巢癌原位模型，檢測Rictor對高轉移性卵巢癌細胞腹腔轉移的影響，免疫組織化學法檢測Rictor在體內對EMT相關指標及轉錄因子Zeb1的影響；并通過生存分析檢測Rictor對小鼠

4、卵巢癌原位模型的生存的影響。
　　結果：Rictor在卵巢癌組織中高表達，并與卵巢癌的分級相關。Rictor在漿液型卵巢癌組織樣本中表達最為明顯，且在轉移灶中表達更高。成功建立腹腔高轉卵巢癌細胞株，此細胞株較親代低轉細胞發(fā)生上皮間質化現象Ecadherin下調，且Rictor表達增加。經shRNA干擾Rictor表達后，逆轉卵巢癌細胞發(fā)生的上皮間質化過程，卵巢癌細胞的體外轉移能力降低，減少斑馬魚體內轉移。Rictor對卵巢癌的上皮

5、間質化過程是通過經典轉錄因子Zeb1實現。Rictor下調后降低卵巢癌細胞在小鼠腹腔的轉移，在體內逆轉卵巢癌細胞發(fā)生的上皮間質化，延長卵巢癌原位模型的生存期。
　　結論：因此提出Rictor可通過Zeb1調控卵巢癌細胞的上皮間質化過程，影響卵巢癌體內體外的侵襲轉移，是抑制卵巢癌腹腔轉移的較好的分子靶點。通過深入了解Rictor如何影響卵巢癌的體內侵襲轉移，可以尋找影響Rictor的功能的可以獲得有效的卵巢癌腫瘤治療藥物，為治療卵巢

6、癌提供新的思路。
　　第二部分 條件性敲除Rictor的小鼠卵巢癌模型
　　目的：轉基因小鼠卵巢癌模型能非常近似模擬人類卵巢癌的發(fā)生過程，是研究人類卵巢癌發(fā)生機制的極佳工具。通過研究Kras/Pten卵巢癌小鼠模型的發(fā)生特點，尋找Rictor在轉基因小鼠卵巢癌模型發(fā)生中的作用。
　　方法：通過將Kras(G12D)小鼠與Pten(flox/flox)小鼠雜交，構建Kras(G12D)Pten(flox/flox)基因型

7、小鼠。通過卵巢囊注射表達Cre酶的腺病毒，引起Kras(G12D)Pten(flox/flox)小鼠卵巢癌的發(fā)生。免疫組化鑒定小鼠卵巢癌病灶中mTOR通路指標及Rictor的變化。將Rictor（flox/flox)小鼠與Kras(G12D)Pten(flox/flox)小鼠雜交，構建Kras（G12D）Pten(flox/flox)Rictor(flox/flox)基因型小鼠。
　　結果：成功建立Kras（G12D）Pten(f

8、lox./flox)基因型小鼠并誘發(fā)內膜樣卵巢癌。mTOR通路相關指標及Rictor在Kras(G12D)Pten(flox/flox)基因型卵巢癌組織中表達升高。成功構建Kras（G12D）Pten(flox/flox)Rictor(flox/flox)基因型小鼠。
　　結論：mTOR通路在Kras(G12D)Pten(flox/flox)基因型卵巢癌活化，Rictor表達升高，提示Rictor在卵巢癌的發(fā)生中起到作用。成功構建

9、Kras（G12D）Pten(flox/flox)Rictor(flox/flox)小鼠為進一步研究Rictor在卵巢癌發(fā)生進展中的作用提供了基礎。
　　第三部分 mTOR抑制劑PP242與HDAC抑制劑SAHA通過凋亡與自噬協同殺傷卵巢癌細胞
　　目的：組蛋白去乙酰化是表觀遺傳學的一個重要組成部分，在卵巢癌的發(fā)生與進展中的經常發(fā)生，影響相應基因功能。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白酶（mTOR)在卵巢癌中也是較常見的活化激酶，通過聯

10、合應用組蛋白乙?；敢种苿㏒AHA與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白酶抑制劑PP242對卵巢癌細胞系進行體外與體內殺傷，研究新的卵巢癌治療方法。
　　方法：利用CCK-8法檢測SAHA與PP242在不同濃度聯合下對卵巢癌細胞系SKOV3、A2780的增殖抑制效應，并通過計算機軟件CalcuSyn計算兩者之間的協同效應指數（combination index，CI）。利用流式細胞儀檢測單獨與聯合藥物處理后的卵巢癌細胞凋亡情況，Western

11、Blot法檢測凋亡標志性蛋白PARP與Caspase-3的表達與變化情況。卵巢癌細胞通過轉染慢病毒表達GFP標記的LC3蛋白后，進行藥物處理，熒光顯微鏡下檢測GFP-LC3聚集點的情況以反映細胞在藥物處理下的自噬效應。Western blot法檢測自噬相關蛋白LC3與P62蛋白的變化情況。通過原位注射卵巢癌細胞系于NOD/SCID免疫缺陷小鼠，建立卵巢癌原位模型，并進行藥物單獨與聯合治療以評估藥物對體內腫瘤的殺傷效應。
　　結果：

12、聯合應用SAHA與PP242能夠明顯增強體外腫瘤增殖抑制效應，該效應CI值小于1，表明其為協同效應。流式細胞儀檢測凋亡可明顯發(fā)現SAHA與PP242聯合后凋亡顯著增加，該凋亡是通過經典Caspase-3/PARP凋亡通路引起。SAHA與PP242聯合后顯著增加PP242引起的自噬體的形成，自噬相關蛋白LC3在聯合藥物處理組顯著轉化為LC3B，P62蛋白明顯上調。免疫缺陷小鼠卵巢癌原位模型中，藥物聯合組顯著抑制卵巢癌腫瘤細胞增殖，并明顯延