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文檔簡介
1、肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人類的健康和生命。越來越多的研究表明,導致肝癌治療失敗及死亡率高的根本原因是肝癌的轉移、復發(fā)和耐藥,而肝癌干細胞在肝癌的轉移、復發(fā)及耐藥中發(fā)揮重要作用。因此,靶向肝癌干細胞治療肝癌有望降低其轉移、復發(fā)及耐藥,提高療效,降低死亡率。本研究具體內容與結果概括如下:
1、肝癌干細胞的鑒定
目的:探究人肝癌細胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中是否存在肝癌干細胞。
2、方法:采用無血清懸浮培養(yǎng)法和PKH26染色法確定人肝癌細胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中存在肝癌干細胞。運用流式細胞術檢測細胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中的干細胞標志物。
結果:Bel7402-V13和MHCC97-L細胞經無血清培養(yǎng)均可成為球,成球率分別為55%和22%。該兩株細胞經無血清懸浮培養(yǎng)11d后形成的細胞球體中存在單個PKH26陽性細胞。流式熒光結果顯示,在Bel7402-V13細胞中
3、ESA+細胞在sphere細胞中的比例為8.43%,較親本細胞的2.58%上升了3.4倍;在MHCC97-L細胞中CD90+細胞的比例為3.41%,而在sphere細胞中CD90+細胞比例約為10.3%,MHCC97-L細胞經無血清懸浮培養(yǎng)后,CD90+細胞的比例提升了3.0倍。
結論:人肝癌細胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中存在肝癌干細胞,其干細胞標志物分別為ESA和CD90。
2、抗人肝癌干細胞單抗
4、的篩選與鑒定
目的:探討靶向肝癌干細胞單克隆抗體的生物學特征及其體內外功能。
方法:采用流式熒光檢測單抗21A3識別的細胞在Bel7402-V13和MHCC97-L親本及sphere細胞中的比例。運用雙色流式熒光和雙色細胞免疫熒光檢測單抗21A3識別的抗原與兩株細胞的干細胞標志物的共染情況。流式細胞術在Bel7402-V13 sphere細胞中分選出的21A3+、親本和21A3-細胞后,采用無血清懸浮培養(yǎng)法、Tran
5、swell實驗、CCK8法及小鼠體內致瘤實驗,分別檢測其成球能力、侵襲能力、耐藥能力及動物體內致瘤能力。運用與上述相同的實驗方法分別檢測單抗21A3對Bel7402-V13和MHCC97-L sphere細胞自我更新能力、侵襲能力和耐藥能力的影響。裸鼠體內治療實驗分析單抗21A3聯合順鉑對Bel7402-V13移植瘤生長的抑制作用。
結果:首先,在細胞系Bel7402-V13中,我們采用流式熒光檢測發(fā)現21A3+細胞在sphe
6、re細胞中較親本細胞升高了4倍,表明21A3識別的細胞具有腫瘤干細胞的特征;采用雙色細胞免疫熒光和雙色流式熒光檢測結果發(fā)現,單抗21A3識別的抗原分子能與肝癌干細胞標志物ESA共染,表明其可識別肝癌干細胞;將流式分選獲得21A3+細胞、親本細胞和21A3-細胞進行成球、侵襲、耐藥和裸鼠體內致瘤能力的分析,發(fā)現21A3+細胞比21A3-細胞具有更強的成球、侵襲、耐藥和體內致瘤能力,證明單抗21A3是一株抗肝癌干細胞的單抗。體外功能研究結果
7、顯示,單抗21A3能顯著抑制肝癌干細胞的成球和侵襲能力,抑制率分別達到23.9%和50.8%,且能顯著降低細胞對順鉑的耐藥能力;單抗21A3靶向肝癌干細胞體內治療實驗研究結果顯示,停藥時,高、低劑量單抗對移植瘤的抑制率分別為71.5%、54.4%,化療藥的抑制率為83.5%,而抗體聯合化療藥對移植瘤的抑制率則達到了97%。
采用同樣的路線和方法,在另一株人肝癌細胞系MHCC97-L中研究單抗21A3的體外功能。流式熒光和細胞免
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