局部溫?zé)釋PV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的促凋亡作用及促炎癥細(xì)胞因子的影響.pdf

1、人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一組嗜黏膜和皮膚上皮的雙連環(huán)狀DNA病毒，其感染靶器官主要為上皮組織，顯示高度的宿主特異性，對人體特異部位的上皮細(xì)胞具親和力。它可引起尋常疣、扁平疣、跖疣等非生殖道疾病，也可引起尖銳濕疣等多種生殖道疾病。現(xiàn)已鑒定出120余種HPV基因型?，F(xiàn)階段臨床治療上主要采用理化(如冷凍、電灼術(shù)、高熱激光、化學(xué)腐蝕)、細(xì)胞毒類藥物等創(chuàng)傷性方法治療病毒疣。這

2、些手段的基本原理是清除HPV感染的皮膚組織達(dá)到治療目的。但這些方法引起的痛苦度高，治療后需要較長時間的創(chuàng)傷恢復(fù)期(多有瘢痕形成)，不易被患者接受。 熱療是一種利用物理方法將組織器官或全身加熱的治療手段，目前熱療在臨床上的應(yīng)用分為三類：局部熱療(包括淺表加熱、腔內(nèi)熱療和插植熱療)，區(qū)域熱療(包括深部腫瘤加熱以及各種熱灌注技術(shù))和全身熱療。其中局部高溫(local hyperthermia)治療皮膚疾病已經(jīng)有幾十年的歷史。在過去的幾

3、十年內(nèi)，局部溫?zé)嵩糜谥委焺游锖腿祟惗喾N表淺和深層的良惡性腫瘤。有報道加熱溫度在39℃—45℃范圍的溫?zé)嶂委?，在臟器腫瘤及感染性疾病中發(fā)揮積極的作用。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)有成功利用灸烤療法治療皮膚疣的經(jīng)驗。國外有一些臨床報告，初步觀察到溫?zé)釋こｐ?、跖疣有較好的治療效果，且溫?zé)嶂委煑l件溫和，未見有嚴(yán)重急慢性損傷的報道。 雖然局部熱療在病毒疣的治療中具有較好的療效，但目前尚無關(guān)于其治療作用機(jī)制的報道。Peter Stern等認(rèn)為溫?zé)嶂委燄?/p>

4、的主要原理是病灶組織與正常組織相比對溫?zé)岣舾?，熱損傷后更不易恢復(fù)；作者同時認(rèn)為溫?zé)釋C(jī)體免疫功能的影響也可能是導(dǎo)致疣消退的原因之一。Pfau等也推測可能是溫?zé)嵋鸩∽兘M織壞死，物理性地去除了HPV病毒，如同其它破壞性物理治療手段一樣；也可能是由于溫?zé)嶂苯右鸩《酒茐乃禄蛘呤怯捎谘装Y反應(yīng)導(dǎo)致病毒的去除。Gatto等發(fā)現(xiàn)43℃溫?zé)釛l件下角質(zhì)形成細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了部分改變，包括：胞漿萎縮，胞間隙增加和細(xì)胞核膨脹，但生物活性不受影響；在44℃

5、或更高的溫度下，角質(zhì)形成細(xì)胞死亡率升高。 因此，我們推測溫?zé)嶂委煵《攫嗫赡艿臋C(jī)制為：1、促進(jìn)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡；2、促進(jìn)局部免疫反應(yīng)以清除病毒；3、對HPV病毒本身產(chǎn)生影響。因HPV不能在體外培養(yǎng)，我們采用尖銳濕疣組織標(biāo)本作為病毒載體，利用溫?zé)嶂委焹x進(jìn)行不同溫度照射，采用器官培養(yǎng)的模式，模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察不同溫度處理對HPV感染皮膚的影響。尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是由HPV感染引起的一

6、種常見的性傳播疾病，發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。該病傳染性大，對社會和家庭危害極大，嚴(yán)重影響患者身心健康。臨床上CA治療困難，并存在治療后高復(fù)發(fā)率的難題，這對控制該病的傳播及流行造成很大困難，因而越來越受到人們的重視。 李曉東等研究表明溫?zé)崽幚砗蠹怃J濕疣皮損內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞數(shù)目明顯減少、密度降低、胞體縮??；隨溫度逐漸升高，LC從表皮中游走的數(shù)量增加，且成熟LC逐漸增多，LC表面特異性趨化因子受體CCR6表達(dá)逐漸下降，而CCR7的表達(dá)逐

7、漸增加。說明溫?zé)崮軌虼龠M(jìn)LC成熟，促進(jìn)LC的遷移和增強(qiáng)抗原提呈能力，LC通過真皮向局部淋巴結(jié)遷移，在局部細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用(待發(fā)表)。在表皮內(nèi)，LC與角質(zhì)形成細(xì)胞密切接觸，并有功能的聯(lián)系。角質(zhì)形成細(xì)胞合成分泌的促炎癥因子對LC的功能活性有影響。 因此，本研究擬開展以下兩個方面工作：1)探討溫?zé)崾欠衲艽龠M(jìn)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生凋亡，以及可能的凋亡途徑；2)檢測溫?zé)崮芊裼绊懡琴|(zhì)形成細(xì)胞合成分泌促炎癥細(xì)胞因子，以了解角質(zhì)形成細(xì)

8、胞在抗HPV免疫應(yīng)答中的作用。 材料與方法： 一、標(biāo)本處理 經(jīng)患者知情同意后，取12例經(jīng)臨床及病理確診的尖銳濕疣患者的疣體；其中男4例，皮損取自肛周；女8例，皮損均取自外陰。年齡22～48歲，平均32.6歲；病程1～6個月，平均2.1個月。每份標(biāo)本等分成4份：一份直接凍存：另3份真皮側(cè)向下，使組織浸于RPMI1640培養(yǎng)液中。利用溫?zé)嶂委焹x(遠(yuǎn)紅外光源，具有溫度反饋系統(tǒng)，輸出溫度誤差為±0.1℃)將3份組織分別加

9、熱至37℃，42℃，45℃，持續(xù)30分鐘；然后將溫?zé)崽幚砗蟮慕M織放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12h，—70℃凍存?zhèn)溆谩?例正常皮膚取自整形術(shù)后。 二、HPV分型 采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver．3.0 DNA純化試劑盒提取DNA，采用HPV6/11型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

10、三、原位檢測細(xì)胞凋亡 冰凍切片經(jīng)4％多聚甲醛固定后，采用原位缺口末端標(biāo)記檢測(TUNEL)法檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡情況，選5個高倍視野計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，取其平均值，并進(jìn)行各組間比較。 四、凋亡相關(guān)基因mRNA的檢測 采用熒光實時定量PCR方法檢測DR4、DR5、Fas、Bax、Bcl—2mRNA的表達(dá)。 按Trnzol試劑說明書提取總RNA；用TIANScript M—MLV試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；SYB

11、R—Green法進(jìn)行熒光實時定量PCR擴(kuò)增，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量分析。反應(yīng)條件：95℃2分鐘，(95℃15秒，56℃30秒，68℃40秒)40個循環(huán)。 五、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化SP法檢測Fas、Bax、Bcl—2蛋白的表達(dá)。 六、細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 采用熒光實時定量PCR方法檢測CCL—20、TNF-α、IL-1α mRNA的表達(dá)。方法同四。 七、統(tǒng)計學(xué)分析 凋

12、亡細(xì)胞數(shù)、凋亡相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)采用方差分析和獨立樣本t檢驗。凋亡細(xì)胞數(shù)與凋亡基因mRNA表達(dá)相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析，凋亡相關(guān)蛋白免疫組化結(jié)果采用Mann Whitney Test分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 一、角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡 凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為胞核固縮狀，呈棕褐色著色。尖銳濕疣未處理組可見少量凋亡細(xì)胞位于顆粒層及棘層上部，明顯高于正常皮膚；37℃組凋亡細(xì)胞有所增多，但與未處

13、理組比較無統(tǒng)計學(xué)意義；42℃及45℃照射組角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡顯著增多，甚至分布于表皮全層，凋亡細(xì)胞數(shù)分別為58.03±12.45、66.21±8.82，與未處理組及37℃組比較有顯著性差異(p<0.01)，結(jié)果表明尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡隨溫度升高而增加。不同溫度處理的CA組織細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)與感染的HPV型別無關(guān)。正常皮膚溫?zé)崽幚砗?，角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡細(xì)胞隨溫度升高明顯增加，呈溫度依賴性。 二、凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 尖銳濕

14、疣皮損內(nèi)DR4、DR5、Fas、Bax、Bcl—2 mRNA表達(dá)均高于正常組織。溫?zé)崽幚砗驞R4、DR5、Fas、Bax mRNA隨溫度升高表達(dá)明顯升高，Bcl—2的表達(dá)隨溫度升高而下降。正常皮膚組織溫?zé)崽幚砗螅S溫度升高Fas、Bax表達(dá)明顯升高，而DR4、DR5、Bcl—2未見明顯變化。CA凋亡細(xì)胞數(shù)與DR4、DR5、Fas、Bax表達(dá)呈正相關(guān)，與Bcl—2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡與Fas、Bax表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

15、 三、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 尖銳濕疣皮損內(nèi)Fas、Bax、Bcl—2蛋白表達(dá)高于正常組織。溫?zé)崽幚砗驠as、Bax蛋白隨溫度升高表達(dá)明顯增加，而Bcl—2蛋白溫?zé)崽幚砗笪匆娒黠@表達(dá)。正常組織中未見明顯Fas、Bcl—2蛋白表達(dá)，Bax蛋白少量陽性表達(dá)，隨溫度升高Fas、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，而Bcl—2未見明顯表達(dá)。 四、細(xì)胞因子的表達(dá) 尖銳濕疣皮損內(nèi)CCL—20、TNF-α、IL-1α mRNA的表達(dá)高于正

16、常皮膚，溫?zé)崽幚砗驝CL—20、IL-1α mRNA表達(dá)下降，而TNF-α表達(dá)未見明顯變化。正常皮膚45℃溫?zé)崽幚砗驝CL—20、IL-1α mRNA表達(dá)升高，TNF-α表達(dá)無明顯變化。 結(jié)論： 1、局部溫?zé)峥纱龠M(jìn)尖銳濕疣及正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡，尤其是溫度達(dá)42℃以上，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是溫?zé)岚l(fā)揮作用的機(jī)制之一。 2、尖銳濕疣皮損內(nèi)DR4、DR5、Fas、Bcl—2、Bax mRNA的表達(dá)及Fas、Bcl—2、B

17、ax蛋白的表達(dá)高于正常組織。溫?zé)峥赏ㄟ^上調(diào)凋亡促進(jìn)基因DR4、DR5、Fas、Bax的表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制基因Bcl—2的表達(dá)誘導(dǎo)尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡。在正常皮膚溫?zé)峥赏ㄟ^促進(jìn)Fas、Bax的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 3、尖銳濕疣皮損內(nèi)CCL—20、TNF-α、IL-1α mRNA水平高于正常皮膚組織。溫?zé)崽幚砗蠹怃J濕疣皮損內(nèi)CCL—20、IL-1α mRNA水平下降。正常皮膚45℃溫?zé)崽幚砗驝CL—20、IL-1α mRNA表達(dá)