STRA8、BOULE和DAZL基因過表達(dá)誘導(dǎo)山羊BMSCs向雄性生殖細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、家畜優(yōu)良性狀的傳遞是通過生殖細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。因此，了解生殖細(xì)胞的發(fā)育和分化，有利于培育高品質(zhì)的家畜種群。然而，生殖細(xì)胞發(fā)生過程復(fù)雜，在體內(nèi)難以獲得且不易示蹤，一直是研究生殖細(xì)胞發(fā)生的難點(diǎn)。干細(xì)胞具有獨(dú)特的自我更新和多向分化能力，這使其成為了研究生殖細(xì)胞發(fā)育的有利工具。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymal stem cells，BMSCs)是一類存在于骨髓中的成體干細(xì)胞，取材方便且具有與胚胎干細(xì)胞相似的多向分化潛能，是目前用

2、于誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞的研究熱點(diǎn)。研究表明，通過維甲酸(retinoic acid, RA)誘導(dǎo)等方式，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人和小鼠BMSCs體外向生殖細(xì)胞方向發(fā)生轉(zhuǎn)分化，但獲得的細(xì)胞均難以突破減數(shù)分裂。生殖細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生過程是在一系列相關(guān)基因調(diào)控下完成的，其中STRA8(stimulated by retinoic acidgene8)主要在生殖細(xì)胞由有絲分裂轉(zhuǎn)入減數(shù)分裂前表達(dá)，是生殖細(xì)胞重要的標(biāo)記基因;BOULE和DAZL是DAZ(deleted

3、 in azoospermia)基因家族的重要成員，DAZL在生殖細(xì)胞性別分化、減數(shù)分裂啟動(dòng)等過程中發(fā)揮作用，BOULE在生殖細(xì)胞發(fā)生的后期表達(dá)，參與調(diào)控精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子成熟等過程。近期的許多研究表明，通過人為調(diào)控細(xì)胞分化過程中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，可以有效地引起干細(xì)胞向特定的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化。因此，本研究以山羊BMSCs為研究對(duì)象，嘗試通過過表達(dá)生殖細(xì)胞特異基因STRA8、BOULE和DAZL的方式來誘導(dǎo)山羊BMSCs體外向雄性生

4、殖細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，探索多基因質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄mRNA非整合性過表達(dá)的誘導(dǎo)體系，為研究哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)生機(jī)理提供模型。主要的試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一、山羊STRA8基因的表達(dá)及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　為研究STRA8基因在山羊睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)，本試驗(yàn)首先通過免疫組化和qRT-PCR法檢測STRA8基因在10日齡、4月齡、8月齡山羊睪丸組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，STRA8在不同發(fā)育階段的山羊睪丸組織中均表達(dá)，主要定位

5、于精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞核中，其mRNA表達(dá)水平伴隨著山羊睪丸發(fā)育而逐漸升高，其中8月齡組的STRA8基因表達(dá)水平顯著高于10日齡組和4月齡組(P＜0.05)。然后通過PCR法克隆得到了1104 bp的山羊STRA8基因CDS序列，并亞克隆至pEX-4載體上。測序和雙酶切試驗(yàn)表明，成功構(gòu)建山羊STRA8基因真核表達(dá)載體pEX-4-STRA8。
　　試驗(yàn)二、山羊BOULE和DAZL基因的表達(dá)及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　為

6、進(jìn)一步分析BOULE和DAZL基因在山羊睪丸組織中的表達(dá)特點(diǎn)，本試驗(yàn)首先通過免疫組化和qRT-PCR法檢測BOULE和DAZL基因在10日齡、4月齡、8月齡山羊睪丸組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，BOULE主要定位于精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在精原細(xì)胞中不表達(dá);DAZL主要定位于精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。BOULE和DAZL基因在8月齡組的mRNA表達(dá)水平均顯著高于10日齡組和4月齡組（P＜0.05）。然

7、后通過PCR法對(duì)山羊BOULE和DAZL基因的CDS區(qū)進(jìn)行克隆，分別得到了816 bp的BOULE基因CDS區(qū)序列和966bp的DAZL基因CDS區(qū)序列，并分別亞克隆至pEX-4和pEGFP-C1載體上。測序和雙酶切試驗(yàn)表明，成功構(gòu)建了山羊BOULE和DAZL基因真核表達(dá)載體pEX-4-BOULE和pEGFP-DAZL。
　　試驗(yàn)三、多基因質(zhì)粒DNA誘導(dǎo)山羊BMSCs向雄性生殖細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化的研究
　　本試驗(yàn)建立了多基因質(zhì)粒

8、DNA誘導(dǎo)體系，通過過表達(dá)STRA8、BOULE和DAZL基因，促進(jìn)山羊BMSCs向生殖細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化。通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEX-4-STRA8(iSTRA8)、pEX-4-BOULE(iBOULE)、pEGFP-DAZL(iDAZL)及三個(gè)質(zhì)?；旌衔?iSBD)，進(jìn)一步對(duì)比STRA8、BOULE和DAZL基因單獨(dú)過表達(dá)和共同過表達(dá)在生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)過程中的效率。結(jié)果顯示，各組誘導(dǎo)后的細(xì)胞均不同程度地表達(dá)原始生殖細(xì)胞(primordi

9、al germ cells，PGCs)分子標(biāo)記STELLA、C-KIT、MVH，雄性生殖細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)記DAZL、PIWIL2、RNF17，減數(shù)分裂相關(guān)分子標(biāo)記SCP3。此外，在iSTRA8、iDAZL和iSBD組誘導(dǎo)后的細(xì)胞中，減數(shù)分裂相關(guān)蛋白SCP3的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。這表明通過多基因質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方式，可以誘導(dǎo)山羊BMSCs向雄性生殖細(xì)胞方向發(fā)生轉(zhuǎn)分化，也提示了STRA8、BOULE和DAZL基因所形成的

10、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能在生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。
　　試驗(yàn)四、多基因mRNA誘導(dǎo)山羊BMSCs向雄性生殖細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化的研究
　　本試驗(yàn)進(jìn)一步嘗試通過體外轉(zhuǎn)錄合成STRA8、BOULE和DAZL基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)目的基因在山羊BMSCs中非整合性過表達(dá)。分別對(duì)山羊BMSCs進(jìn)行8天3次mRNA轉(zhuǎn)染，其中共同過表達(dá)組(mi-SBD)3次均轉(zhuǎn)染STRA8、BOULE和DAZL基因的mRNA混合物，時(shí)序性過表達(dá)組(mi-S+B

11、D)3次分別轉(zhuǎn)染STRA8、STRA8+BOULE+DAZL、BOULE+DAZL的不同mRNA組合，進(jìn)一步模擬STRA8、BOULE和DAZL基因在生殖細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育過程中的表達(dá)時(shí)序性。結(jié)果顯示，首先，OCT4、STELLA、C-KIT、MVH、PIWIL2、RNF17、SCP3等生殖細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)記的mRNA表達(dá)水平在誘導(dǎo)后的兩組細(xì)胞中均出現(xiàn)不同程度地上調(diào)。其次，DAZL蛋白廣泛表達(dá)于mi-SBD和mi-S+BD兩組誘導(dǎo)后細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)

12、中;誘導(dǎo)后兩組細(xì)胞中均出現(xiàn)SCP3陽性細(xì)胞，并且SCP3蛋白的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）;MVH蛋白的表達(dá)水平在mi-SBD和mi-S+BD兩組誘導(dǎo)后的細(xì)胞中均得到顯著上調(diào)（P＜0.05），且mi-S+BD組顯著高于mi-SBD組(P＜0.05)。此外，mi-SBD組細(xì)胞的H19基因甲基化率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而mi-S+BD組的甲基化率極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。這表明mRNA誘導(dǎo)的山羊BMSCs已初步