牛雄性生殖系干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及冷凍保存技術(shù)的研究.pdf

1、雄性生殖系干細(xì)胞是一群具有高度自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞，它能向子代傳遞遺傳信息，是雄性成體內(nèi)唯一可復(fù)制的二倍體永生細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因技術(shù)與雄性生殖系干細(xì)胞異體及異種移植技術(shù)相結(jié)合，將會(huì)為克隆動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)及一些人類(lèi)遺傳性疾病的基因治療提供新的機(jī)遇與途徑，在醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)采用組合酶消化和選擇貼壁法，對(duì)5月齡、6月齡牛胎兒及新生牛雄性生殖系干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及冷凍保存進(jìn)行了研究，以期為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究提

2、供依據(jù)，結(jié)果如下： 1．牛睪丸支持細(xì)胞分離純化后進(jìn)行體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示：這一階段牛睪丸適宜支持細(xì)胞分離純化用；采用0.25﹪胰蛋白酶+0.02﹪EDTA二次消化法是一種經(jīng)濟(jì)有效的牛胎兒睪丸支持細(xì)胞分離方案；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牛胎兒睪丸支持細(xì)胞體外研究時(shí)間應(yīng)控制在3天～20天內(nèi)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牛胎兒睪丸支持細(xì)胞，對(duì)牛體外受精卵體外發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用。 2．牛雄性生殖系干細(xì)胞分離純化后與睪丸支持細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示：睪丸支持細(xì)胞

3、對(duì)雄性生殖系干細(xì)胞體外增殖、分化是必需的，同時(shí)對(duì)數(shù)期睪丸支持細(xì)胞對(duì)雄性生殖系干細(xì)胞貼壁、增殖與分化效果明顯；共培養(yǎng)16天后，牛雄性生殖系干細(xì)胞成功分化為長(zhǎng)形精子細(xì)胞，試驗(yàn)初步建立了牛雄性生殖系干細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)分化體系。 3．牛雄性生殖系干細(xì)胞分離純化后，進(jìn)行冷藏、冷凍保存研究。結(jié)果顯示：牛胎兒睪丸4℃低溫保存的上限時(shí)間為48h；牛胚胎程序化冷凍、精液冷凍及胚胎玻璃化冷凍保存方案，不適于雄性生殖系干細(xì)胞的冷凍保存；雄性生殖系干細(xì)