(TiTaNbZr)90Mo10合金對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化的影響.pdf

1、目的：
　　顳下頜關(guān)節(jié)疾病長期以來一直困擾著人們，對于顳下頜關(guān)節(jié)強直、顳下頜關(guān)節(jié)腫瘤、髁突粉碎性骨折等顳下頜關(guān)節(jié)疾病，藥物治療雖然能緩解疼痛，卻不能從根本上提升關(guān)節(jié)的功能。而人工關(guān)節(jié)置換卻可以達到解決這些問題的目的。目前臨床上常用的人工關(guān)節(jié)材料主要有CoCrMo合金、人工陶瓷以及超高分子量聚乙烯。但是，CoCrMo人工關(guān)節(jié)容易發(fā)生無菌性松動，人工陶瓷容易發(fā)生破碎，超高分子量聚乙烯耐磨性差。因此，中科院金屬研究所研制出一種新型的人工

2、關(guān)節(jié)材料--(TiZrNbTa)90Mo10合金，它具有與鑄態(tài)CoCrMo合金相當(dāng)?shù)木C合力學(xué)性能，有較強的耐磨性和耐腐蝕性，并具有良好的生物相容性，沒有毒性離子釋放，期望成為替代鑄態(tài)CoCrMo合金的備選材料。(TiTaNbZr)90Mo10作為一種新型醫(yī)用合金極具應(yīng)用前景，其生物相容性亟待評價。生物相容性是金屬材料的生物特性的醫(yī)學(xué)研究的重要組成部分，目前，人們在使用新材料前都需要經(jīng)過生物相容性測試。本實驗從生物學(xué)角度，以純鈦為對照，因

3、為純鈦為目前臨床公認的生物相容性較好的材料，通過比較大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在(TiTaNbZr)90Mo10及純鈦表面的增殖分化來探究(TiTaNbZr)90Mo10的生物相容性。
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　細胞原代培養(yǎng)選擇SD大鼠，提取骨髓間充質(zhì)干細胞，對細胞進行成骨、成脂肪誘導(dǎo)染色的鑒定，并應(yīng)用流式細胞儀檢測，鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞的純度。
　　2、細胞粘附
　　按照2×104個細胞/片的密度接種后

4、培養(yǎng)24小時，通過掃描電鏡觀察細胞在材料表面的粘附情況。按照4×104個細胞/片的密度接種后培養(yǎng)3小時、24小時，熒光顯微鏡觀察細胞在材料表面的粘附情況。
　　3、細胞增殖
　　以2×104個細胞/片的密度接種，放于24孔板中培養(yǎng)1、3、5、7天，應(yīng)用阿爾瑪藍檢測細胞在材料表面的增殖。
　　4、細胞分化
　　以2×104個細胞/片的密度接種，放于24孔板中培養(yǎng)，待細胞長至70％匯合度，加入成骨誘導(dǎo)劑，分別誘導(dǎo)1、

5、4、7、14天測堿性磷酸酶的變化;誘導(dǎo)14、21天測骨鈣素的變化;誘導(dǎo)21天進行茜素紅染色定性定量檢測材料表面的成骨礦化量。細胞以5×104個細胞/片的密度接種于6孔板的金屬片上，誘導(dǎo)4、7、14天，對Runx2、COLⅠ、OCN、OPN進行Real-time PCR檢測。
　　結(jié)果：
　　1、細胞的原代培養(yǎng)與鑒定
　　顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代骨髓間充質(zhì)干細胞為典型的長梭形或多角形形態(tài)，融合的細胞呈典型的螺旋狀生長趨勢，

6、符合骨髓間充質(zhì)干細胞的典型形態(tài)和生長特點。對細胞進行成骨、成脂肪誘導(dǎo)后染色，堿性磷酸酶染色顯示，細胞質(zhì)成藍色;VonKossa染色顯示，有大量礦化顆粒產(chǎn)生;油紅O染色顯示，有紅色脂滴形成。流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示，細胞表面高表達CD90和CD44標(biāo)志物，不表達造血干細胞表面的CD11b和CD45標(biāo)志物。以上均表明所提取的細胞為未分化的骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2、掃描電鏡和熒光顯微鏡結(jié)果
　　掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞接種24小時

7、以后，細胞在兩種材料表面均鋪展良好并且均有大量絲狀偽足伸展出，說明兩種材料均有助于細胞在其表面的粘附。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)細胞接種于材料表面3小時后，兩種材料表面的細胞均剛剛鋪展開，并且在細胞周圍均有粘著斑蛋白產(chǎn)生。接種24小時后，兩種材料表面的細胞均鋪展良好并且在細胞周圍也均有粘著斑蛋白產(chǎn)生。觀察結(jié)果表明，兩種材料均有助于細胞在其表面粘附。
　　3、AlamarBlue檢測結(jié)果
　　隨著培養(yǎng)時間的增加，兩種材料表面的細胞活

8、性呈現(xiàn)遞增趨勢(p＜0.05)，并于第5天發(fā)現(xiàn)(TiTaNbZr)90Mo10表面的細胞活性高于cp-Ti(p＜0.05)。
　　4、ALP定量檢測結(jié)果
　　細胞培養(yǎng)1、4、7、14天后，雖然(TiTaNbZr)90Mo10表面的堿性磷酸酶活性稍高于純鈦，但兩組間并無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。從1到7天，兩種材料表面堿性磷酸酶的含量呈遞增趨勢(p＜0.05)，說明兩種材料均有利于間充質(zhì)干細胞的早期成骨分化。并且在成骨

9、誘導(dǎo)第14天發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性明顯降低(p＜0.05)，說明此時細胞已經(jīng)分化為較成熟的成骨細胞。
　　5、OCN定量檢測結(jié)果
　　于成骨誘導(dǎo)14、21天，兩種材料表面的骨鈣素的量隨時間增加而增多(p＜0.05)，雖然(TiTaNbZr)90M010表面的骨鈣素含量稍高于純鈦表面，但是兩種材料表面的骨鈣素量無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　6、茜素紅染色結(jié)果
　　體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，兩種材料表面均有鈣鹽沉

10、積，并且鈣結(jié)節(jié)被茜素紅染成紅色。定量結(jié)果顯示，(TiTaNbZr)90Mo10表面的細胞礦化量稍高于純鈦表面的礦化量，但是兩種材料表面的礦化量并無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　7、Real-time PCR結(jié)果
　　隨著成骨誘導(dǎo)的時間增加，Runx2持續(xù)表達，COLⅠ呈遞減趨勢(p＜0.05)，OCN、OPN呈遞增趨勢(p＜0.05)，并且這4種蛋白基因的表達量在兩種材料表面并沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(p＞0.05)。<