AIM2、NLRP3炎性小體在腹主動脈瘤患者外周血單個核細胞中的表達及與年齡相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　腹主動脈瘤(Abdominal aortic aneurysm，AAA)是以腹主動脈呈節(jié)段性、永久性、不可逆擴張為特點的血管疾病。隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)改變、影像診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，AAA發(fā)病率呈逐年上升趨勢。AAA一旦破裂，死亡率高達65-85％，但目前尚無可靠的用于監(jiān)測AAA破裂風險的指標。人工血管移植、腔內(nèi)修復術(shù)是治療AAA的首選方案，但隨著對AAA發(fā)病機制不斷深入地研究，使藥物、基因等治療手段干預AAA逐漸成

2、為可能。
　　臨床流行病學研究認為AAA危險因素包括年齡、性別、高血壓、吸煙等因素，其中年齡被認為是AAA最主要的危險因素。慢性炎性細胞浸潤貫穿于AAA形成、發(fā)展，是AAA最顯著病理特征之一。AAA瘤壁存在大量T淋巴細胞、巨噬細胞(Macrophages)浸潤，并釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)和各類細胞因子如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α

3、)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL1β)等。既往動物實驗表明，在應用彈力蛋白酶灌注法建立小鼠AAA模型中，IL1B基因敲除將直接抑制AAA的形成，提示IL-1β在AAA發(fā)病環(huán)節(jié)中具有關(guān)鍵作用。綜上所述，年齡、慢性炎癥反應兩大因素構(gòu)成了AAA發(fā)病、進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。炎性衰老是指機體在衰老進程中，表現(xiàn)出的低水平的、慢性促炎癥反應狀態(tài)。AAA平均發(fā)病年齡為70歲以上，有學者

4、認為炎性衰老與AAA、動脈粥樣硬化等血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。目前，炎性衰老的機制尚不明了，自噬學說認為自噬功能與炎性小體（Inflammasome）交互作用失調(diào)可能與炎性衰老有關(guān)。
　　炎性小體是一類存在于包漿內(nèi)的多蛋白復合體，它能激活半胱天冬氨酸酶-1(pro-Caspase-1)，繼而活化的Caspase-1能夠?qū)o活性的pro-IL-1β、pro-IL-18切割為成熟的IL-1β、IL-18，從而調(diào)控炎癥反應。炎性小

5、體由受體蛋白、斑點樣凋亡相關(guān)蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)以及Caspase-1（或Caspase-5）構(gòu)成。其中，受體蛋白主要分為NOD樣受體(Nod-likereceptors，NLRs)家族以及HIN-200家族(The interferon-inducible p200-protein)，分別以NLRP3、黑素瘤缺乏因子2(Abs

6、ent in melanoma2，AIM2)受體蛋白為代表。NLRP3能夠感受不同的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(Danger-associated molecular patterns，DAMP)，而AIM2作為細胞質(zhì)雙鏈DNA(Double stranded DNA，dsDNA)感受器，能夠感受外源性或內(nèi)源性dsDNA。炎性小體激活分為炎性

7、小體預激(Priming)、活化(Triggering)兩個階段。前者是指在IFN-γ、腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosisfactor receptor，TNFR)、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)等預激信號的刺激下，AIM2、NLRP3、IL1B mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的過程，后者則是指感受器受體在第二信號（活化信號，如dsDNA、DAMP、PAMP等）的刺激下完成炎性小體裝配的過程。炎性小體預

8、激對炎性小體激活過程有重要作用，它可以影響活化階段炎性小體裝配所需第二信號刺激閾值，從而誘導慢性炎癥反應、自身炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展。
　　目前，炎性小體表達與年齡相關(guān)性在人體中尚未證實。AIM2、NLRP3炎性小體作為調(diào)節(jié)IL-1β表達、成熟的蛋白復合物，其在AAA患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中的表達以及與AAA破裂風險的相關(guān)性在國內(nèi)外均無研究。本研究采用分子

9、生物學技術(shù)結(jié)合生物力學有限元分析(Finite element analysis，F(xiàn)EA)，旨在研究炎性小體表達與年齡相關(guān)性、AAA患者PBMC中AIM2、NLRP3炎性小體的表達及與AAA破裂風險的相關(guān)性，為臨床上治療、干預AAA提供新的思路和理論。
　　方法：
　　1、通過ELISA、Real time PCR和Western Blot方法在mRNA、蛋白表達水平上，對77例血管疾病患者PBMC中AIM2、NLRP3炎性

10、小體表達進行分析，研究炎性小體預激、活化兩個階段與年齡的相關(guān)性。
　　2、第二部分共納入34例AAA患者以及性別、年齡(±3歲)匹配的34例對照組患者（1∶1配對），通過ELISA、Real time PCR和Western Blot方法研究NLRP3、AIM2炎性小體在AAA患者PBMC中的表達情況。
　　3、通過生物力學有限元分析，確定每個AAA患者個體化的AAA破裂風險指標，包括瘤壁應力峰值(Peak wall str

11、ess，PWS)、瘤壁最大破裂風險指數(shù)(Peak wallrupture risk index，PWRR)以及破裂風險相當?shù)膭用}瘤直徑(Rupture risk equivalentdiameter，RRED)，研究炎性小體下游炎癥因子IL1B與AAA破裂風險的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、在血管疾病患者中，AIM2、NLRP3炎性小體各組分mRNA表達水平與年齡呈正相關(guān)(AIM2: r=0.245; P=0.032; NL

12、RP3: r=0.367; P=0.001; ASC: r=0.252;P=0.027; CASP1: r=0.296; P=0.009; CASP5: r=0.453; P=0.000; IL1B: r=0.247;P=0.030）。應用多元線性回歸分析校正AAA、周圍動脈疾病(Peripheral arterydisease，PAD)混雜因素后，上述相關(guān)性依然顯著(P＜0.05)。Caspase-1 p10蛋白活性、血漿IL-1β水

13、平與年齡無關(guān)（P＞0.05）。
　　2、AAA組血漿IL-1β水平高于對照組(0.26[0.00-1.65] vs.0.02[0.01-0.03],P=0.00017)。CASP1、IL1B mRNA在AAA組表達水平高于對照組(CASP1:1.06[0.85-1.97] vs.1.01[0.76-1.62]，P=0.028),(IL1B:3.69[1.40-6.83] vs.1.36[0.40-2.68]，P=0.0001)。在

14、蛋白表達水平上，AAA患者dsDNA感受器受體AIM2、active Caspase-1 p10蛋白表達水平顯著高于對照組(0.98[0.49-1.16] vs.0.64[0.37-0.84]，P=0.014; Caspase-1 p10:(0.43[0.27-0.66] vs.0.34[0.23-0.51],P=0.049)，而NLRP3蛋白在AAA組表達水平低于對照組(0.03[0.01-0.05] vs.0.05[0.02-0.2

15、2]，P=0.038)。
　　3、所有68例患者中男性AIM2、ASC、CASP1、CASP5、IL1B mRNA表達水平高于女性(AIM2:1.27[0.84-1.83] vs.0.70[0.31-1.14]，P=0.004; ASC:3.05[1.92-5.20]vs.1.57[0.67-2.67]，P=0.008; CASP1:1.14[0.89-1.90] vs.0.84[0.56-1.09]，P=0.010;CASP5:

16、1.50[0.94-2.33] vs.0.35[0.12-1.08]，P=0.0001; IL1B:2.51[1.21-5.75] vs.0.39[0.11-2.85]，P=0.0028)。
　　4、女性AAA患者PWRR(0.76[0.58-1.00] vs.0.48[0.41-0.52]，P=0.002)、RRED（78.30[63.80-96.45] vs.55.50[49.00-59.20]，P=0.002）顯著高于男性A

17、AA患者。男性AAA中，IL1B mRNA表達水平與PWS(τ=0.378，P=0.021)、PWRR(τ=0.333，P=0.046)、RRED(τ=0.333，P=0.046)呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、在血管疾病患者中，炎性小體mRNA表達水平與年齡呈正相關(guān)，提示炎性小體預激（Priming）水平上調(diào)可能與炎性衰老有關(guān)，這為預防和治療包括AAA在內(nèi)的炎性衰老相關(guān)性疾病提供了重要的理論依據(jù)和新的靶點。
　　2、

18、AIM2炎性小體介導的慢性炎癥損傷與AAA密切相關(guān)，為臨床上干預、治療AAA提供了新的靶點。
　　3、男性患者PBMC中AIM2炎性小體預激(Priming)水平高于女性，可能是導致AAA發(fā)病呈性別差異性的原因之一。
　　4、本研究采用分子生物學技術(shù)結(jié)合生物力學有限元分析，首次發(fā)現(xiàn)IL1BmRNA表達水平與男性AAA患者動脈瘤破裂風險呈正相關(guān)，提示IL1B可能成為預測男性AAA患者動脈瘤進展的標志物或防止AAA破裂新的靶點。