線粒體內(nèi)膜蛋白Mic60過表達(dá)對血管紋邊緣細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:探討線粒體內(nèi)膜蛋白Mic60過表達(dá)對大鼠內(nèi)耳血管紋邊緣細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。
  方法:(1)取出生0-3天的新生SD大鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋組織進(jìn)行原代培養(yǎng),經(jīng)純化后的邊緣細(xì)胞(MCs)在普通光學(xué)顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下觀察、鑒定。(2)50Um/ml葡萄糖氧化酶作用邊緣細(xì)胞4hr后誘導(dǎo)MCs氧化應(yīng)激模型,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。(3)免疫熒光及Western Blot觀察Mic60在MCs中的表達(dá)及分布情況。用M

2、Cs感染預(yù)實驗篩選出Mic60-GFP-Ad及GFP-Ad感染邊緣細(xì)胞的合適滴度。(4)將體外培養(yǎng)的原代MCs根據(jù)不同的處理分為四組:C組即未經(jīng)任何處理的對照組;GO組即葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)建立的氧化應(yīng)激模型組;Mic60-組即原代培養(yǎng)的MCs轉(zhuǎn)染空載病毒GFP-Ad后再經(jīng)葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型組;Mic60+組即原代培養(yǎng)的MCs轉(zhuǎn)染Mic60-GFP-Ad后再經(jīng)葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的氧化模型組。(5)流式細(xì)胞儀上檢測各組細(xì)胞內(nèi)的ROS

3、水平,Western Blot檢測Mic60、SOD1、SOD2在MCs中的蛋白水平。
  結(jié)果:(1)在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到MCs接種后培養(yǎng)24hr后貼壁生長,單層可融合形成典型的“鋪路石”樣外觀,后期可見數(shù)個細(xì)胞重疊生長形成的“dome”樣結(jié)構(gòu)。在免疫熒光鏡下觀察檢測到MCs上皮細(xì)胞特異性蛋白CK18表達(dá)呈陽性。(2)50Um/ml葡萄糖氧化酶作用邊緣細(xì)胞4hr后,流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比其

4、細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著上升(p<0.01)。(3)免疫熒光觀察Mic60主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),Western Blot結(jié)果表明Mic60在線粒體內(nèi)表達(dá)。通過MCs感染預(yù)實驗篩選出Mic60-GFP-Ad及GFP-Ad的合適滴度,分別為1.2×107 PFU/ml、1.0×107 PFU/ml。免疫熒光鏡下觀測到腺病毒轉(zhuǎn)染MCs48hr后其表達(dá)較強且細(xì)胞狀態(tài)較好。(4)流式細(xì)胞儀檢測四組離體培養(yǎng)的MCs中ROS的水平,發(fā)現(xiàn)GO組、Mic60-

5、組ROS水平較C組均升高(p<0.01);但Mic60+組與Mic60-組相比較ROS水平顯著降低(p<0.01)。(5)Western Blot檢測各組Mic60、SOD1、SOD2在MCs線粒體中的蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)GO組、Mic60-組Mic60、SOD1、SOD2的蛋白表達(dá)水平較C組略有升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05);Mic60+組Mic60、SOD2蛋白水平較Mic60-組顯著升高(p<0.01),但SOD1表達(dá)上升不具有統(tǒng)

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