蓮房原花青素誘導ROS積蓄介導HepG2細胞自噬和凋亡的研究.pdf

1、蓮房是蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的成熟花托( lotus seedpod)。蓮房富含多種生物體合成所必需化學成分包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、酚類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、微量元素、酸類物質(zhì)、必需氨基酸等。然而卻被當作廢棄物大量丟棄，資源未被利用，造成浪費。課題組研究發(fā)現(xiàn)蓮房中原花青素(procyanidins of lotus seedpod, LSPCs)含量很高，并確定LSPCs是由兒茶素或表兒茶素以C4

2、-C8或C4-C6鍵連接而成的2-4聚體組成的化合物。LSPCs已被證實有抗氧化、抗炎消腫、止血化瘀、抗輻射、降血脂、延緩衰老以及抗腫瘤等多種生物活性，并通過實驗發(fā)現(xiàn)初步確定LSPCs誘導人肝癌HepG2細胞自噬和凋亡。本論文致力于研究LSPCs通過活性氧(ROS)積蓄介導HepG2細胞自噬、凋亡及其分子機制，并且基于ROS研究LSPCs誘導的細胞凋亡和自噬之間的相關(guān)性以及共同調(diào)控的信號通路。具體研究內(nèi)容和實驗結(jié)果如下：
　　1.

3、 LSPCs誘導ROS積蓄介導HepG2細胞自噬的研究
　　利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HepG2細胞活性；單丹磺酰戊二胺(MDC)熒光染色實驗和綠色熒光膜連輕鏈蛋白3(GFP-LC3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗用來檢測自噬小體的含量及分布、透射電鏡及激光共聚焦用來觀察自噬小泡的結(jié)構(gòu)形態(tài)；Western blotting法檢測自噬蛋白膜連輕鏈蛋白3(LC3)的表達；流式細胞儀檢測細胞周期變化；氧化敏感探針(DCFH-DA)檢測細胞內(nèi)ROS

4、含量；JC-1染色用來檢測線粒體膜電位；彗星實驗用來檢測細胞DNA損傷。結(jié)果如下：
　　（1）LSPCs抑制HepG2細胞增殖具有時間和劑量依賴效應。100μg/mL的LSPCs作用HepG2細胞96 h后，細胞抑制率達到最高值(89.20±5.10)％。LSPCs作用細胞6~96h后，IC50值在(495.51±0.34)μg/mL和(29.66±0.27)μg/mL之間。
　?。?）LSPCs誘導HepG2細胞自噬。其中

5、，50μg/mL的LSPCs作用細胞24h后，誘導自噬的效果最明顯，細胞內(nèi)自噬小體分布最多且熒光強度最強，同時LC3自噬蛋白熒光也最強以及自噬小泡數(shù)量最多，LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換明顯增多，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)能夠抑制LSPCs誘導的自噬。
　?。?）LSPCs可以阻滯HepG2細胞于S期，降低細胞周期蛋白A的表達，并且導致細胞DNA損傷。3-MA可以防止細胞阻滯于S期，上調(diào)細胞周期A的表達，預防LSPCs造

6、成的DNA損傷。
　?。?）LSPCs可誘導HepG2細胞內(nèi)ROS大量積蓄，且ROS生成量隨LSPCs濃度的升高而升高，并導致線粒體膜電位損失。ROS抑制劑N-acetylcysteine(NAC)能夠抑制LSPCs誘導的自噬，降低細胞的死亡率。LSPCs誘導ROS積蓄介導HepG2細胞自噬性死亡可能與線粒體通路有關(guān)。
　　2. LSPCs誘導ROS積蓄介導HepG2細胞凋亡的研究
　　利用MTT法用來檢測LSPCs對

7、HepG2細胞的生長抑制作用；Hochest33258染色觀察細胞核固縮，染色質(zhì)凝聚狀況；Annexin V-FITC/PI雙染色用來檢測細胞早期及晚期凋亡率；彗星實驗用來檢測細胞DNA損傷；DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS含量， JC-1染色用來檢測線粒體膜電位變化；Western blotting法檢測cytochrome c、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果如下：
　?。?）LSPCs

8、顯著抑制HepG2細胞增殖，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(Z-VAD)、ROS的抑制劑NAC均能削弱LSPCs對HepG2細胞增殖的抑制作用。
　?。?） LSPCs誘導HepG2細胞凋亡。LSPCs作用細胞后，核染色體高度凝聚，細胞核碎裂，核固縮，染色質(zhì)凝聚的細胞數(shù)從3.86%增至42.76%；活細胞率急劇減少，凋亡率從對照組的5.32%增至67.05%；cytochrome c、caspase-3、caspase-9蛋白的表達

9、量顯著增加。Z-VAD和NAC能有效抑制LSPCs造成的細胞凋亡。
　　（3）LSPCs誘導HepG2細胞內(nèi)ROS積蓄，導致細胞DNA損傷及線粒體膜電位的損失，Bax蛋白的表達增加，Bcl-2蛋白的表達減少，Bax/Bcl-2的比例值升高。結(jié)果表明LSPCs可通過ROS介導的線粒體途徑誘導細胞凋亡。另外，Z-VAD和NAC能夠抑制線粒體膜電位損失及caspase相關(guān)蛋白的表達，阻斷LSPCs導致的細胞凋亡。
　　3. LSP

10、Cs誘導ROS積蓄介導HepG2細胞自噬與凋亡相關(guān)通路的研究
　　Hochest33258染色觀察100μg/mL LSPCs作用24 h后細胞凋亡形態(tài)，Annexin V-FITC/PI雙染色檢測凋亡率，研究3-MA對凋亡作用的影響；利用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測100μg/mL LSPCs作用24 h后細胞自噬形態(tài)，研究Z-VAD對自噬作用的影響；Western blotting法檢測自噬與凋亡共同調(diào)節(jié)的蛋白通路包括Bax、B

11、ad、Bcl-2、磷脂酰肌醇3羥基激酶PI3K/AKT/mTOR、絲/蘇氨酸蛋白激酶ERK及c-Jun氨基末端激酶JNK等信號通路蛋白的表達。結(jié)果如下：
　?。?）自噬抑制劑3-MA能夠下調(diào)LSPCs引起的HepG2細胞核聚縮作用，顯著降低細胞凋亡率，結(jié)果表明抑制自噬能夠抑制LSPCs誘導的凋亡。
　?。?）凋亡抑制劑Z-VAD能夠阻止GFP-LC3蛋白轉(zhuǎn)移至自噬雙層膜，綠色熒光斑點顯著減少，且對應的LC3-II蛋白表達量減

12、少，結(jié)果表明抑制凋亡能夠抑制LSPCs誘導的自噬。
　　（3）3-MA和NAC預處理后Bax和Bad、cleaved caspase3蛋白表達均呈現(xiàn)下降，Bcl-2的蛋白表達增加，3-MA、NAC抑制了凋亡蛋白的表達，線粒體蛋白通過ROS積蓄介導自噬和凋亡。
　?。?）P13K通路的抑制劑3-MA、ROS抑制劑NAC可以抑制PI3K，P-AKT和P-mTOR蛋白的表達量的下調(diào)以及cleaved caspase3的增加，結(jié)果顯

13、示通過阻滯PI3K/AKT/mTOR信號通路可以促進細胞自噬和凋亡。LSPCs誘導的ROS積蓄參與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR途徑，從而調(diào)控HepG2細胞的自噬與凋亡。
　?。?）LSPCs作用細胞后，P-JNK、P-ERK、自噬蛋白LC3-II以及凋亡蛋白cleaved caspase3表達量增加，表明LSPCs通過促進JNK、ERK的磷酸化，誘導HepG2細胞自噬與凋亡。JNK通路抑制劑SP600125和NAC均能抑制JNK