ROS改變和線粒體損傷在PIG11高表達誘導HepG2細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:建立穩(wěn)定高表達PIG11(p53-induced protein11,p53誘導基因11)蛋白的HepG2細胞株,研究PIG11誘導細胞凋亡過程中的ROS(reactive oxygen species,活性氧)和線粒體改變,闡明PIG11誘導細胞凋亡的分子機制。
　　方法:采用本課題組已凍存的pLXSN-PIG11逆轉錄病毒液,在polybrene協(xié)助下感染HepG2細胞,經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定表達PIG11蛋白的Hep

2、G2細胞,Western Blot和免疫細胞化學染色鑒定感染后HepG2細胞PIG11蛋白的表達情況。DNA Ladder、PI染色流式檢測細胞的凋亡情況。用Rh123(rhodamine123)標記,流式測定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,Δψm)。Western Blot檢測胞漿和線粒體組分中Cyt C的含量變化。DCFH-DA熒光探針標記細胞內ROS,流式檢測ROS水平的改變。

3、>　　結果:成功建立穩(wěn)定高表達PIG11蛋白的HepG2細胞株,Western Blot及免疫細胞化學檢測證實PIG11蛋白高表達。PI染色流式凋亡檢測結果顯示pLXSN-PIG11-HepG2細胞凋亡率為18.60％±1.25,高于HepG2組(3.81%±0.46)和pLXSN-HepG2組(6.03%±0.97)(P<0.01)。pLXSN-PIG11-HepG2細胞可見明顯的DNA Ladder條帶,而HepG2組和pLXSN-

4、HepG2組細胞均未見明顯的DNA ladder出現(xiàn)。
　　流式細胞儀檢測Rh123熒光強度,結果顯示:pLXSN-PIG11-HepG2細胞熒光強度(5.4±0.15)顯著低于HepG2細胞(14.7±0.56)和pLXSN-HepG2細胞(13.2±0.53)(P<0.01)。用CsA(10μM)抑制各組細胞的線粒體通透性轉移孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)后

5、,流式凋亡檢測結果顯示pLXSN-PIG11-HepG2細胞凋亡率明顯降低。Cyt C的Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)存在線粒體損傷及之后的Cyt C向胞漿釋放。
　　流式測定胞內ROS水平變化,結果顯示pLXSN-PIG11-HepG2細胞內ROS水平(15.60±0.92)明顯高于pLXSN-HepG2細胞(4.90±0.70)和HepG2細胞(5.37±1.17)(P<0.01)。NAC(10mM)清除各組細胞內的ROS后

6、,流式凋亡檢測結果顯示清除胞內ROS的pLXSN-PIG11-HepG2細胞凋亡率(7.75%±0.34)較未清除ROS的pLXSN-PIG11-HepG2細胞凋亡率(18.60%±1.25)有明顯降低。CsA(10μM)抑制各組細胞的MPTP后,pLXSN-PIG11-HepG2組ROS降低至8.10±0.30(P<0.05)。
　　結論:成功獲得穩(wěn)定高表達PIG11蛋白的HepG2細胞株;PIG11高表達可誘導HepG2細胞凋