體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞α7尼古丁型乙酰膽堿能受體調(diào)控β-淀粉樣蛋白聚集的作用.pdf

1、目的：研究激活星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的α7尼古丁乙酰膽堿能受體（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）后對(duì)調(diào)控β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）聚集的作用。
　　方法:分離新生大鼠大腦皮質(zhì)，培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞并純化、傳代，使用細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定細(xì)胞及純度；體外制備Aβ寡聚體；將培養(yǎng)細(xì)胞分為對(duì)照組、激動(dòng)劑組、拮抗劑+激動(dòng)劑組以及 Aβ組、激動(dòng)劑+Aβ組、拮抗劑+激動(dòng)劑

2、+Aβ組。激動(dòng)劑有尼古丁、PNU、s24795，拮抗劑為甲基牛扁亭（methyllycaconitine, MLA）。用蛋白印跡法（Western blotting）和逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription, PCR）法檢測(cè)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)nAChR不同亞單位的表達(dá)；蛋白印跡法和凝膠銀染方法鑒定 Aβ寡聚體聚集情況；用 CCK-8方法測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率；使用蛋白印跡法檢測(cè)加入激動(dòng)劑后α7 nAChR的表達(dá)以及A

3、β蛋白是否降解。
　　結(jié)果：采用免疫熒光法鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞占所有細(xì)胞的95％以上。除β3外，星形膠質(zhì)細(xì)胞中α2、α3、α4、α7及β2 nAChR亞單位在蛋白及mRNA水平均有表達(dá)。體外制備的Aβ除了含少量的未聚集的單體（4 kDa)外，主要以二聚體、三聚體、九聚體等不同聚集形式的寡聚體存在；CCK-8方法顯示Aβ寡聚體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的神經(jīng)毒性作用，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。檢測(cè)α7 nAChR蛋白表達(dá)結(jié)果

4、顯示：（1）尼古丁組與對(duì)照組比較，尼古丁組的α7 nAChR表達(dá)明顯增高（P<0.01），MLA+尼古丁組與尼古丁組比較，加入拮抗劑組的α7 nAChR表達(dá)降低（P<0.05）；（2） PNU組與對(duì)照組比較，PNU組的α7 nAChR的表達(dá)增加（P<0.05），MLA+PNU組與PNU組相比，α7 nAChR表達(dá)降低（P<0.05）；（3）s24795組與對(duì)照比較， s24795組的α7 nAChR表達(dá)明顯升高（P<0.01），MLA+

5、s24795組與s24795組比較，加入拮抗劑組的α7 nAChR表達(dá)明顯降低（P<0.01）。檢測(cè)Aβ蛋白的表達(dá)結(jié)果為：（1）收集細(xì)胞的上清液及蛋白，分別進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組正常的細(xì)胞內(nèi)沒有Aβ蛋白的表達(dá)，尼古丁+Aβ組與Aβ組相比，尼古丁+Aβ組的Aβ蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.01），MLA+尼古丁+Aβ組與尼古丁+Aβ組比較，MLA+尼古丁+Aβ組的 Aβ蛋白的表達(dá)均明顯升高（P<0.01）；（2）收集細(xì)胞的上清液及蛋白，分別進(jìn)行檢

6、測(cè)。對(duì)照組正常的細(xì)胞內(nèi)沒有Aβ蛋白的表達(dá)，PNU+Aβ組與Aβ組相比，PNU+Aβ組的蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.01），MLA+PNU+Aβ組與PNU+Aβ組比較，MLA+PNU+Aβ組的蛋白表達(dá)均升高（P<0.05）；（3）收集細(xì)胞的上清液及蛋白，分別進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組正常的細(xì)胞內(nèi)沒有Aβ蛋白的表達(dá)，s24795+Aβ組與 Aβ組相比， s24795+Aβ組的 Aβ蛋白表達(dá)均明顯降低（ P<0.01）， MLA+s24795+Aβ組與