星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體與β-淀粉樣蛋白的相互作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：1.研究 Aβ處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體的pH、體積及數(shù)目的變化，闡明 Aβ對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體功能的影響。2.用 bafilomycin A1抑制質(zhì)子泵，觀察溶酶體 pH、數(shù)目變化及溶酶體對(duì)外源性 Aβ降解的影響。3.研究用 NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后觀察其對(duì)外源性 Aβ降解的影響。4.研究 forskolin對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體的p H、體積及數(shù)目的變化，明確 forskolin對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體功能的影響。5.闡明 for

2、skolin處理對(duì)溶酶體降解Aβ的影響。6.研究 forskolin處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)總Aβ含量的影響，闡明forskolin對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞 Aβ含量的影響。
　　方法：取新生1~3天小鼠的大腦皮層，進(jìn)行原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。純化后用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP)的單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞骨架，鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。將活細(xì)胞用 DND-99標(biāo)記以便于動(dòng)態(tài)觀察溶酶體變化。用2

3、00 nM的Aβ42孵育細(xì)胞30 min后，給予細(xì)胞250 nM的bafilomycin A1處理30 min（或用200μM的forskolin處理45 min），1μM的DND-99孵育30 min，活細(xì)胞成像觀察溶酶體的p H、體積及數(shù)目的變化。用200 nM帶綠色熒光標(biāo)記的Aβ42孵育細(xì)胞30 min后，分別給予250 nM的bafilomycin A1和25 mM的NH4Cl處理30 min（或用200μM的forskolin

4、處理45 min），活細(xì)胞成像觀察細(xì)胞內(nèi) Aβ含量的影響。用200 nM的Aβ42孵育細(xì)胞30 min后，用200μM的forskolin處理45 min，裂解細(xì)胞并用 ELISA方法檢測(cè)內(nèi)源性 Aβ42的含量。
　　結(jié)果：1.外源性 Aβ42經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)吞后定位到溶酶體。2. Aβ42處理使細(xì)胞溶酶體 pH降低、溶酶體體積變大以及溶酶體數(shù)目減少。3.細(xì)胞經(jīng) bafilomycin A1堿化以后，溶酶體數(shù)目減少；經(jīng) bafil

5、omycin A1處理以后，內(nèi)吞的Aβ42在細(xì)胞內(nèi)聚集。4.細(xì)胞經(jīng) NH4Cl酸化以后，外源性 Aβ42在細(xì)胞內(nèi)的聚集減少。5. Forskolin處理使細(xì)胞溶酶體 pH降低、溶酶體體積變大以及溶酶體數(shù)目減少；Forskolin處理使外源性 Aβ42在細(xì)胞內(nèi)聚集；Forskolin處理使內(nèi)源性 Aβ42的量增加。
　　結(jié)論：Aβ處理星形膠質(zhì)細(xì)胞30 min后定位到溶酶體。Aβ聚集在星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體中損傷溶酶體正常功能，導(dǎo)致溶酶體