Nrf2-ARE通路在染氟雄性大鼠生殖損傷中的作用及NAC的影響.pdf

1、目的:
　　本課題通過(guò)建立氟染毒大鼠模型，以氟化鈉（NaF）為染毒劑，以N-乙酰半胱氨酸（NAC）為干預(yù)因素，以Nrf2/ARE[核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2( Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件( ARE)]信號(hào)通路為靶點(diǎn)，探討氟染毒對(duì)大鼠睪丸所致的氧化應(yīng)激和DNA損傷，評(píng)估Nrf2/ARE信號(hào)通路在氟化物的生殖毒性中所起作用及NAC的生殖保護(hù)作用，為氟染毒致雄性生殖損傷的中毒機(jī)制及防治措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　

2、1．動(dòng)物分組和處理
　　60只4周齡SPF(Specific pathogen free)級(jí)SD雄性大鼠，體重100~150g。將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、NaF組、NAC組、NAC+NaF組，對(duì)應(yīng)的受試物及劑量為：0.90％氯化鈉溶液（10ml/kg）、25mg/kg/dNaF、150mg/kg/dNAC和25mg/kg/d NaF+150mg/kg/dNAC，處理時(shí)間為7周。
　　2.生殖相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　計(jì)算睪丸

3、和附睪臟器系數(shù)，采用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠精子密度、活動(dòng)率和畸形率，ELISA法檢測(cè)血清睪酮含量，采用HE(Hematoxylin and eosin)染色法觀察生精小管形態(tài)，用氟離子選擇電極測(cè)定睪丸氟含量。
　　3.氧化和DNA損傷相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，鉬酸銨比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活力，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力。ELISA法檢測(cè)血清和睪丸

4、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷酸（8-OHdG）含量，免疫組織化學(xué)法測(cè)定睪丸中8-OHdG的表達(dá)情況。
　　4. Nrf2/ARE通路相關(guān)分子的檢測(cè)
　　熒光定量PCR法和免疫印跡法分別測(cè)定睪丸Nrf2及下游因子血紅素氧合酶（HO-1）和醌氧化還原酶（NQO1）的mRNA及蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.雄性生殖功能指標(biāo)分析結(jié)果
　　與對(duì)照組相比，NaF組的大鼠睪丸氟含量明顯升高，體重、睪丸和附睪濕重、精子質(zhì)量和數(shù)量、

5、睪酮含量顯著降低，睪丸和附睪臟器系數(shù)無(wú)明顯變化，曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯紊亂。與NaF組相比，NAC預(yù)處理組的大鼠睪丸氟含量沒(méi)有明顯降低，體重、睪丸和附睪濕重、精子質(zhì)量和數(shù)量及睪酮含量沒(méi)有明顯升高，曲細(xì)精管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善。
　　2．氧化和DNA損傷分析結(jié)果
　　與對(duì)照組相比，NaF組的大鼠血清MDA含量、血清和睪丸8-OHdG水平及睪丸8-OHdG免疫染色強(qiáng)度明顯升高，且免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)主要分布在胞質(zhì)，表現(xiàn)為彌散性的胞質(zhì)棕黃

6、色或棕色顆粒物，血清SOD和CAT活力顯著降低。與NaF組相比，NAC預(yù)處理組的大鼠血清MDA含量、8-OHDG水平和8-OHdG免疫染色強(qiáng)度明顯降低，血清SOD和CAT活力沒(méi)有明顯升高，但有改善趨勢(shì)。
　　3．Nrf2/ARE通路的表達(dá)結(jié)果
　　與對(duì)照組相比，NaF組和NAC組的大鼠睪丸Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA表達(dá)均明顯升高；與NaF組相比，NAC預(yù)處理組的大鼠睪丸Nrf2的mRNA表達(dá)明顯降低、HO-1和N

7、QO1的mRNA表達(dá)無(wú)明顯降低。與對(duì)照組相比，NaF組和NAC組的大鼠睪丸胞核Nrf2與胞質(zhì)HO-1和NQO1蛋白表達(dá)量均明顯升高，而胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異；與NaF組相比，NAC預(yù)處理組的大鼠睪丸胞核和胞質(zhì)Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)量均明顯降低，而NQO1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　氟化物暴露可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激而引起雄性生殖DNA損傷，同時(shí)能激活Nrf2/ARE信號(hào)通路。NAC預(yù)處理可一定程度上促進(jìn)N