Nrf2-ARE信號通路在鑭所致神經毒作用中的作用研究.pdf

1、目的:稀土元素（rare earth elements，REEs）包括輕稀土元素，以鑭、鈰為代表和以釔、镥為代表的重稀土元素。鑭(Lanthanum，La)，緣于其性質活潑和在自然界中較為豐富被作為研究REEs毒作用的代表物質。研究已經表明REEs可經口，呼吸道和皮膚吸收等途徑進入機體，并在多種組織器官中蓄積。Feng的研究發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)6w經灌胃攝入氯化鑭（lanthanum chloride，LaCl3）(2 mg/kgBW/day)

2、后，海馬中的La含量為0.014±0.007μg/g。自孵化期E9至E16每日注射2 mg/kg LaCl3后，小雞大腦中的La可達0.029±0.011μg/g。仔鼠自孕期至斷乳后經飲水染La(0.5％ LaCl3)后大鼠海馬中鑭含量接近0.04μg/g。據此，認為鑭可穿透血腦屏障進入大腦組織并在中樞神經系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中蓄積。小劑量的稀土元素可引起hormesis效應，然而高劑量可對機體多

3、系統(tǒng)多臟器造成損害，其中神經系統(tǒng)相較于其他組織和器官更為敏感。流行病學調查結果顯示居住于稀土礦區(qū)的兒童，其血REEs含量達2.18±1.08 ng/g時會表現(xiàn)出智商和認知水平明顯下降，動物實驗表明，REEs可導致CNS發(fā)育缺陷。鑭暴露后小雞的長期記億受到損傷。Morris water maze試驗結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，亞慢性暴露于LaCl3的大鼠的學習記憶能力顯著下降。以上的研究表明鑭具有明顯的神經毒性。因此，隨著REEs的普遍應用，

4、腦中累積的鑭對神經系統(tǒng)的損害作用不容忽視，但其確切的機制至今仍不清楚。
　　有研究顯示LaCl3可造成原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質細胞的嚴重損傷，而且LaCl3可誘發(fā)原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經元胞內產生過量的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)。ROS水平過高是組織細胞內發(fā)生氧化應激的一個重要標志。核因子NF-E2相關因子（nuclear factor erythroid2-related factor,

5、Nrf2）-抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路是組織細胞應答氧化應激反應最重要的防御體系之一。一旦暴露于ROS，Nrf2就會與其胞漿內抑制蛋白(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)解離，轉位入核，與小MAF蛋白結合形成異二聚體后再綁定于ARE序列，從而驅動Nrf2依賴性基因的轉錄和表達，這包括解毒酶類和抗氧化酶類基因。例如血紅素加氧合酶

6、1(haemeoxygenase1，HO-1)，依賴還原型輔酶醌氧化還原酶1(NADP(H): dehydrogenasequinone1，NQO1)，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS），谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S transferase，GST)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathi

7、one peroxidase，GSH-Px)，谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)等，在神經細胞抵御由化學毒物引發(fā)的氧化損傷方面發(fā)揮極為重要的作用。Nrf2-ARE信號通路活化可拮抗H2O2誘發(fā)的大鼠大腦星形膠質細胞凋亡和壞死，增加神經元對谷氨酸毒性的耐受能力，而Nrf2缺失或活化受抑的神經細胞會增加對化學毒物所致的氧化損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失調和線粒體損傷的敏感性。更為有趣的是，有研究顯示Nrf2和其下游的信號分子

8、與學習記憶過程有很大的相關性?；谝陨系难芯拷Y果，本次研究采用整體動物與體外細胞培養(yǎng)相結合的方法，應用神經行為學、組織病理學、生物化學與分子生物學等技術手段，從ROS生成水平，Nrf2-ARE信號通路活化狀態(tài)以及抗氧化酶的活性與、表達調控等不同層面探討鑭對神經系統(tǒng)的損傷與Nrf2-ARE信號通路之間是否存在聯(lián)系，為進一步闡明鑭的神經毒作用機制，尋找有效干預的分子靶點提供更新的試驗資料與科學依據。
　　研究方法:整體動物試驗，由實驗

9、動物中心（中國醫(yī)科大學）提供的健康成年Wistar大鼠總計100只（雌性∶雄性=1∶1），體重260±10g，于動物室飼養(yǎng)1w左右以適應周圍環(huán)境。根據隨機化原則將雌鼠分為對照組和少，低，中，高劑量染鑭組，每組10只動物。將雌性和雄性大鼠按照1∶1同籠進行交配，次日清晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者記為妊娠第0d，然后孕鼠單籠飼養(yǎng)并自由攝水。各組子一代大鼠自出生后分別暴露于含0，0.125％ LaCl3，0.25％ LaCl3，0.5％

10、 LaCl3，1.0％ LaCl3的蒸餾水溶液。子代大鼠在斷乳前經由吸吮母乳染鑭，斷乳后則通過自行飲水攝入相應濃度的LaCl3蒸餾水溶液，至斷乳后2個月結束，進行各項指標測定。采用Morris水迷宮測定仔鼠的學習記憶能力，采用透射電子顯微鏡技術觀察仔鼠海馬神經細胞超微結構變化，采用DCFH-DA熒光探針檢測海馬神經細胞內ROS水平，采用real time PCR法和western blot方法檢測仔鼠海馬神經細胞內Nrf2，NQO1，H

11、O-1，γ-GCS，GST，SOD，GSH-Px1，GR mRNA轉錄和蛋白表達水平。
　　體外試驗使用出生24 h之內的wistar仔鼠進行大腦皮層神經元和星形膠質細胞的原代培養(yǎng)。采用神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鑒定神經元和星形膠質細胞。采用DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS水平

12、，采用AnnexinⅤ/PI雙染測定細胞凋亡/壞死率，采用細胞免疫熒光法觀察Nrf2核轉位水平變化，采用real time PCR法和western blot方法檢測神經元和星形膠質細胞內Nrf2，NQO1，HO-1，γ-GCS，GST，SOD mRNA轉錄和蛋白表達水平。使用Nrf2蛋白穩(wěn)定劑叔丁基對苯二酚(Tert-Butylhydroquinone，tBHQ)干預后，對上述各項指標進行再次測定，驗證鑭所致氧化應激與Nrf2-ARE

13、信號通路的關聯(lián)及其對神經元和星形膠質細胞的不利影響。
　　結果:1、LaCl3對仔鼠學習記憶能力的影響。Morris水迷宮定位航行試驗中，隨著染鑭劑量增加，仔鼠找到水下平臺的潛伏期和游泳距離逐漸增加;與對照組相比，仔鼠尋找平臺的路徑表現(xiàn)出雜亂，無目的性，用時增加，游泳距離增長。在空間探索試驗中，染鑭組仔鼠在目標象限的停留時間和穿越目標象限的次數明顯低于對照組，搜索平臺策略目的性降低，甚至很少進入目標象限。2、LaCl3對仔鼠海馬神

14、經細胞超微結構的影響。對照組仔鼠海馬內神經細胞結構完整，胞質內細胞器較豐富，棒狀或球狀的線粒體分布于胞漿內，豐富的內質網周圍附著許多呈小顆粒狀的核糖體，高爾基體表現(xiàn)正常，多個扁平樣囊泡堆積，周圍散布著或大或小的運輸小泡，核膜邊緣光滑連續(xù)完整;染鑭組仔鼠海馬神經細胞內質網，高爾基體，線粒體均受到損傷，表現(xiàn)為數量減少，線粒體出現(xiàn)空泡樣變化，溶酶體內內體數量增多，核膜邊緣凹凸不平，核膜連續(xù)性受到損傷。3、LaCl3對神經細胞內ROS、MDA水

15、平，GSH含量，抗氧化酶活力的影響。體內、體外實驗中，LaCl3可造成神經細胞內ROS過量產生，MDA水平增加，GSH含量減少，抗氧化酶活力減弱。4、LaCl3對星形膠質細胞凋亡率/壞死率影響。體外實驗中，隨著LaCl3處理濃度的增加，星形膠質細胞凋亡率/壞死率逐漸增加。5、LaCl3對Nrf2-ARE信號通路及其靶基因表達水平的影響。隨著染鑭劑量的增加，Nrf2及其靶基因的mRNA轉錄和蛋白的表達水平逐漸減少，明顯低于對照組。6、使用

16、Nrf2的穩(wěn)定劑tBHQ后，Nrf2信號通路被活化，促進抗氧化酶活力表達，拮抗鑭對神經細胞的損傷作用。
　　結論:1、鑭可使仔鼠的空間學習記憶能力下降。2、體內、體外試驗中，鑭可使神經細胞ROS、MDA水平增加，GSH含量減少，抗氧化酶活力降低。3、鑭可干擾Nrf2-ARE信號通路，下調其靶基因的表達水平。4、鑭可明顯影響神經元超微結構，并使神經細胞的凋亡率/壞死率明顯升高。5、使用Nrf2的穩(wěn)定劑tBHQ，可活化Nrf2信號通路