間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒通過傳遞角質(zhì)細(xì)胞生長因子mRNA保護(hù)內(nèi)毒素所致的小鼠急性肺損傷.pdf

1、[目的]本研究組的先前研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過細(xì)胞旁分泌的方式釋放足量的角質(zhì)細(xì)胞生長因子，這些生長因子在調(diào)節(jié)肺水清除率以及減輕肺水腫的過程中起了決定性作用。目前發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠釋放一種100納米至1微米大小的膜微粒，這種類球型的無核顆粒包涵了眾多來自于干細(xì)胞的蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA、細(xì)胞器以及脂質(zhì)等成分，已經(jīng)證實(shí)這些微粒在參與細(xì)胞間信號傳遞的過程中起了關(guān)鍵作用。鑒于這些線索，我們假定微粒可能部分通過傳遞角質(zhì)細(xì)胞生

2、長因子的mRNA至受損的肺泡上皮及肺內(nèi)皮細(xì)胞從而保護(hù)急性肺損傷，擬通過本研究證實(shí)這一可能的作用機(jī)制。
　　[方法](1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放微粒的分離提純:將間充質(zhì)干細(xì)胞置于條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后收集上清。經(jīng)過超高速離心后分離微粒，按照10μl微粒相當(dāng)于1×106的間充質(zhì)干細(xì)胞的比例提純微粒。(2)內(nèi)毒素所致小鼠急性肺損傷模型的建立:小鼠經(jīng)氣管內(nèi)給予內(nèi)毒素(4mg/kg)建立急性肺損傷模型。按照不同的處理進(jìn)行分組:內(nèi)毒素+間充

3、質(zhì)干細(xì)胞氣管給藥治療組(LPS+MSC):內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒靜脈給藥治療組(LPS+1×MSC MV IV);內(nèi)毒素+單倍劑量間充質(zhì)干細(xì)胞微粒氣管給藥治療組(LPS+1×MSC MV IT);內(nèi)毒素+雙倍劑量間充質(zhì)干細(xì)胞微粒氣管給藥治療組(LPS+2×MSC MV IT);內(nèi)毒素+成纖維細(xì)胞微粒氣管給藥治療組（LPS+NHLF MV）。(3)標(biāo)本的采集和檢測:48小時(shí)后對各組小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)研究。

4、利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清及肺泡灌洗液中的MIP-2濃度，并用二辛可寧酸法測定肺泡灌洗液中的蛋白含量。(4)用KGF siRNA干擾處理間充質(zhì)干細(xì)胞來干擾細(xì)胞釋放的微粒中的KGF mRNA:行RT-PCR證實(shí)。(5)接著，用KGFsiRNA干擾微粒處理急性肺損傷小鼠模型:將小鼠隨機(jī)分為內(nèi)毒素組(4mg/kg);內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞KGF siRNA干擾預(yù)處理微粒氣管給藥治療組(LPS+KGFsiRNA MV);內(nèi)毒素+間充

5、質(zhì)干細(xì)胞Negative siRNA干擾預(yù)處理微粒氣管給藥治療組(LPS+Negative siRNA MV)。(6)標(biāo)本的采集和檢測:48小時(shí)后對各組小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究以及肺血管外水含量的檢測。(7)小鼠肺巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞微粒的體外共培養(yǎng):在不同時(shí)間點(diǎn)（6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)）收集培養(yǎng)液上清，用ELISA測定MIP-2、TNF-α、及IL-10的濃度。(8)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SP

6、SS及Prism統(tǒng)計(jì)軟件，變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組計(jì)量資料間比較采用one-way ANOVA分析及Bonferroni校正檢驗(yàn)分析，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)果](1)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒能減少小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中白細(xì)胞的聚集:與單純內(nèi)毒素組相比，內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)下降36％，P＜0.05;內(nèi)毒素+間充質(zhì)干

7、細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)亦下降73％，P＜0.05。(2)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒能抑制小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子的釋放以及蛋白的滲出:與單純內(nèi)毒素組相比，內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中MIP-2含量下降49％，P＜0.05;內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中總蛋白含量亦下降35％，P＜0.05。(3)經(jīng)靜脈給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒同樣能減少小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中的中

8、性粒細(xì)胞并抑制蛋白的滲出:與單純內(nèi)毒素組相比，內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒靜脈給藥組的肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)下降49％，同時(shí)總蛋白含量亦下降34％，P＜0.05。(4)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放微粒的劑量效應(yīng):當(dāng)氣管給予雙倍劑量間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒時(shí)，肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞及MIP-2含量較之單倍劑量的微粒僅有輕度下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(5) LPS體外刺激RAW264.7細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞及微粒共培養(yǎng)不同時(shí)間后上清液炎癥因子的變化

9、:與單純LPS刺激組相比，干細(xì)胞組及微粒組在共培養(yǎng)6小時(shí)后IL-10水平明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。12小時(shí)后，微粒組仍然較單純LPS組明顯升高。但24小時(shí)后，干細(xì)胞組及微粒組的IL-10水平回復(fù)至單純LPS組水平;微粒組在共培養(yǎng)6小時(shí)后TNF-α水平明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。12小時(shí)后，干細(xì)胞組及微粒組TNF-α水平均有減少，且趨勢持續(xù)至24小時(shí);微粒組在共培養(yǎng)6小時(shí)后MIP-2水平明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。12小時(shí)后，干細(xì)胞組及微粒組MIP

10、-2水平均有減少，且趨勢持續(xù)至24小時(shí)，變化趨勢類似于TNF-α。(6) KGF siRNA干擾處理的間充質(zhì)干細(xì)胞微粒對于急性肺損傷小鼠模型的作用:與內(nèi)毒素+Negative siRNA干擾預(yù)處理微粒組相比，內(nèi)毒素+KGFsiRNA干擾預(yù)處理微粒組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)上升47％;內(nèi)毒素+KGFsiRNA干擾預(yù)處理微粒組肺泡灌洗液中MIP-2含量上升56％。(7)急性肺損傷小鼠模型肺血管外水含量的變化:與單純內(nèi)毒素組相比，給予間充質(zhì)

11、干細(xì)胞釋放的微粒組的肺血管外水含量減少45％，其保護(hù)作用類似于間充質(zhì)干細(xì)胞組;與內(nèi)毒素+Negative siRNA干擾預(yù)處理微粒組相比，內(nèi)毒素+KGF siRNA干擾預(yù)處理微粒組的肺血管外水含量增加24％。
　　[結(jié)論](1)在內(nèi)毒素所致的小鼠急性肺損傷模型中，無論是靜脈還是氣管給藥，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒能抑制炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞）的聚集，減少炎癥因子（如MIP-2）的釋放以及肺泡內(nèi)蛋白的滲出;(2)更重要的是，給予間

12、充質(zhì)干細(xì)胞微粒能減少肺血管外水含量（反映肺水腫的指標(biāo)）;(3)間充質(zhì)干細(xì)胞釋放微粒的保護(hù)作用類似于間充質(zhì)干細(xì)胞本身;(4)間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒包涵KGF mRNA，之前的研究已經(jīng)證實(shí)KGF是間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的因子，參與維持肺泡內(nèi)液體清除的功能;(5)無論是靜脈還是氣管給予間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒，肺泡灌洗液中KGF蛋白的含量均明顯升高;(6)經(jīng)KGF siRNA干擾處理的間充質(zhì)干細(xì)胞微粒，其保護(hù)作用部分消失，結(jié)果提示微?？赡懿糠滞ㄟ^傳遞