骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療呼吸機所致肺損傷的動物實驗研究.pdf

1、背景及目的：SARS、甲型H1N1流感病毒等引起的重癥肺部感染可導(dǎo)致急性肺損傷(Acutelung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distresssyndrome,ARDS)。由于ALI/ARDS病情危重、預(yù)后差,其救治已成為目前全世界的重點話題。目前對于ALI/ARDS在內(nèi)的急、慢性呼吸衰竭患者的有效救治手段主要有機械通氣、ECMO等。其中機械通氣作為最主要的手段之一,其使用不當(dāng)即可導(dǎo)

2、致呼吸機所致的肺損傷(Ventilator—induced lung injury,VILI)。
　　 雖然目前對于VILI的發(fā)生機制不完全清楚,但在VILI模型上可發(fā)現(xiàn)其病理上以彌漫肺泡損傷、肺泡-毛細(xì)血管滲透性增加并繼發(fā)以中性粒細(xì)胞(Neutrophil.polymorphonuclear neutrophil,PMN)肺部浸潤顯著增加并伴隨以BALF及全身循環(huán)中PRN升高為主的炎癥反應(yīng)等特征。既往研究顯示PMN的過度激活可

3、加重肺損傷,在VILI模型中PMN的過度激活與肺損傷程度密切相關(guān),而針對PMN激活及其功能的各種干預(yù)手段[如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)阻滯劑、PMN趨化因子MIP-2受體敲除等]可顯著降低肺損傷的嚴(yán)重程度,故對PMN激活及其功能的干預(yù)有望成為防治VILI的有效手段。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow—derived mesenchymal stem cells,MSCs)是

4、一種多能分化的干細(xì)胞,其在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞(如軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等)。在一些嚴(yán)重?zé)齻皳p傷情況下使用MSCs時,MSCs可迅速趨向于損傷部位、獲得一些損傷部位細(xì)胞的表型而發(fā)揮作用,且在肺損傷的研究中也顯示其可獲得肺部細(xì)胞表型、起到促進損傷修復(fù)等重要作用。此外,在膿毒癥肺損傷的動物研究中顯示MSCs使用可改善動物的預(yù)后,然而MSCs在VILI中使用是否也有類似作用目前仍缺乏相關(guān)報道。
　　

5、 MSCs具有抑制免疫活性的功能,這可能是其促進損傷動物組織損傷修復(fù)的一個重要原因。其中MSCs與循環(huán)中的PMN、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞及自然殺細(xì)胞等的相互作用在MSCs發(fā)揮其損傷修復(fù)作用時具有重要意義。新近研究表面MSCs-PMN的體外細(xì)胞實驗、動物實驗結(jié)果均提示MSCs可抑制PMN的激活。然而,MSCs在VILI模型中是否也能抑制PMN的激活目前仍未知。
　　 本研究假設(shè)MSC的輸注可以通過調(diào)節(jié)PMN功能的激活在內(nèi)的

6、炎癥反應(yīng)和(或)通過MSC移植入肺并獲得肺部細(xì)胞表型、重建損傷肺的結(jié)構(gòu)及功能的途徑進而減輕甚至預(yù)防大潮氣量機械通氣導(dǎo)致的肺損傷,對VILI模型起到保護作用。為此,本研究采用大潮氣量機械通氣來制備VILI模型,并在該模型中防治性使用MSCs以評價MSCs在VILI的作用。
　　 第一章、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：體外分離、培養(yǎng)雄性SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),并研究其生物學(xué)特性、表型特

7、征及分化能力。
　　 方法：在無菌條件下取出雄性SD大鼠股骨、脛骨,用冰L—DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,離心取有核細(xì)胞,采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離、純化大鼠MSCs,用含10％胎牛血清的L—DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs,去除非貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞鋪滿瓶底面積約90％時,按1:2進行傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、凋亡率(Annexin—V/PI法),以明確體外培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞的生長特征；用MTT法通過描述細(xì)胞生長曲線以評價目標(biāo)細(xì)胞

8、的增殖活性；用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞表面CD分子CD34、CD45、CD29、CD44的表達,以鑒定目標(biāo)細(xì)胞的純度；用軟骨細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基加轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察誘導(dǎo)的細(xì)胞表達Ⅱ型膠原的情況,以明確目標(biāo)細(xì)胞的定向分化能力。
　　 結(jié)果：從骨髓分離到的目標(biāo)有核細(xì)胞大部分呈圓形,接種于培養(yǎng)基后72 h大部分細(xì)胞貼培養(yǎng)瓶壁、呈集落性生長,細(xì)胞形狀變?yōu)樗笮?。培養(yǎng)10d～15d后,集

9、落增多大部分融合成片并達到傳代標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞傳代之后,細(xì)胞生長速度增快,約1周即可進行再次傳代。在細(xì)胞傳3代后,細(xì)胞形態(tài)仍為梭形、且形態(tài)較為均一。P3細(xì)胞中大部分細(xì)胞處于合成前期(G1期),其比例>80.0％；其次為處于DNA復(fù)制期(S期,約10.0％～12.0％)及DNA合成后期(G2期,約占6.0％～7.5％)的細(xì)胞,而靜止期(G0期)及有絲分裂期(M期)的細(xì)胞占比例極少(G0+M期,約占0.0％～0.4％)；Annexin V/PI法

10、檢測目標(biāo)細(xì)胞凋亡率均<5.0％。細(xì)胞在傳代后第3d進入指數(shù)生長期,到第5d達到高峰；之后進入生長平臺期。培養(yǎng)P3細(xì)胞表面CD29陽性表達率均大于99.50％、CD44陽性表達率均大于99.90％、CD34陽性表達率小于2.50％、CD45陽性表達率小于2.00％。在軟骨細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)14d后,細(xì)胞外形變?yōu)槎嘟切?胞漿中出現(xiàn)Ⅱ型膠原表達的占50％。
　　 結(jié)論：本研究采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法可在體外分離、培養(yǎng)出SD大鼠來

11、源的MSCs。用該方法培養(yǎng)出的MSC大部分處于增殖期,具有增殖活躍、存活率高、純度高的特點,且其具有較高的分化能力。由于其生物學(xué)性狀、表型穩(wěn)定、分化能力較好,可用于進一步的動物實驗研究。
　　 第二章、大潮氣量機械通氣所致肺損傷大鼠模型的制備
　　 目的：用大潮氣量機械通氣制備呼吸機所致肺損傷的SD大鼠模型。
　　 方法：將250～260g體重的成年雌性SD大鼠腹腔內(nèi)注射苯巴比妥鈉麻醉后行氣管切開插入氣管導(dǎo)管,右

12、頸內(nèi)動脈留置頭皮針。插管完畢后將動物分為三組:大潮氣量機械通氣組(VT20組,VT=20 ml/kg體重)、小潮氣量機械通氣組(VT8組,VT=8 ml/kg體重)、非機械通氣對照組(不行機械通氣,在插氣管導(dǎo)管后大鼠自主呼吸)。各組n=12,以上機械通氣組機械通氣設(shè)置為:PEEP=2 cm H2O、RR=40次/分,吸呼比(I:E)均為1:2,吸入的氣體均為空氣,即吸入氧濃度(FiO2)均為21％。機械通氣時間均為2h。機械通氣組在導(dǎo)管

13、置入完畢時(T0)、機械通氣結(jié)束時(T2)、機械通氣結(jié)束后2h時(T4)、機械通氣結(jié)束后4h時(T6)等4個時間點分批取血標(biāo)本后放血處死動物,而非機械通氣對照組則在插管完畢時(T0)、插管完畢后2h(T2)、4h(T4)、6h(T6)分批取血標(biāo)本后放血處死動物。各組各時點均取3只動物。觀察并比較各組各時點動脈血氣、肺干濕比、肺泡灌洗液內(nèi)PMN數(shù)量、肺組織病理。
　　 結(jié)果：1)各組大鼠在整個實驗過程中pH值進行性下降,各時間點間

14、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.029,P=0.001),但組間差異無統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.347,P=0.329)。VT20組在T2時動脈血PaO2/氧合指數(shù)(OI)較T0時顯著下降(均P=0.016),但機械通氣后組內(nèi)各時間點前后動脈血PaO2/OI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(T2比T4,P=0.775；T4比T6,P=0.338)；其它各組組內(nèi)PaO2/OI差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(對照組F=0.603,P=0.531；VT8組F=2.901,P=0

15、.206)。動脈血PaCO2的變化上,分組、時間因素均無顯著影響(時間因素:F=3.503,P=0.082；分組因素:F=0.874,P=0.464)。VT20組在T4時動脈血[HCO3-]濃度較T0、T2均下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.022)；之后維持在T4水平(T6比T4,P=0.497)；而對照組及VT8組在實驗過程中[HCO3-]濃度組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(對照組F=4.200,P=0.064；VT8組F=4.659,P=

16、0.149)。2)對照組及VT8組動物肺濕干比組內(nèi)各時點間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(對照組F=0.336,P=0.658；VT8組F=2.017,P=0.272)；而VT20組動物肺濕干比在機械通氣后隨時間增加而增加,T6時與T0時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。3)對照組及VT8組動物肺組織病理隨時間變化不大,但VT20組出現(xiàn)雙上肺明顯腫脹、包膜下血性滲出,彈性較前明顯降低,肺間質(zhì)水腫、PMN浸潤,肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量血性液體滲出、且肺泡

17、腔內(nèi)出現(xiàn)以PMN為主的細(xì)胞滲出,部分肺組織實變及肺泡出血等損傷改變。且VT20組動物肺泡灌洗液內(nèi)PMN數(shù)量也隨著時間推移而增加,組內(nèi)各時點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=93.182,P=0.000)。
　　 結(jié)論：用20ml/kg體重的潮氣量對SD大鼠進行為期2h的機械通氣可導(dǎo)致大鼠氧合障礙、肺部出現(xiàn)間質(zhì)水腫、肺泡滲出及PMN浸潤為主等急性肺損傷的病理改變,可見本研究采用20ml/kg潮氣量對大鼠行機械通氣2h可成功制備VILI大鼠模型

18、。該研究可為下一步研究提供VILI動物模型。
　　 第三章、MSC給予對于VILI模型肺損傷及炎癥反應(yīng)的影響
　　 目的：明確MSC對VILI模型肺組織損傷及局部、全身炎癥反應(yīng)的影響。
　　 方法：將30只體重為250～260g的成年雌性SD大鼠麻醉后氣管切開插管,右頸內(nèi)動脈留置頭皮針。插管完畢后將動物分為5組:正常對照組(control組)、MSC給予組(MSC組)、大潮氣量機械通氣組(VT20組)、MSCs預(yù)

19、給予+大潮氣量機械通氣組(MSC+VT20組,在大潮氣量機械通氣前給予MSCs)、大潮氣量機械通氣+MSCs后給予組(VT20+MSC組,在大潮氣量機械通氣結(jié)束后立即給予MSCs)。各組n=6,機械通氣組機械通氣參數(shù)為:VT=20 ml/kg體重,PEEP=2 cm H2O,RR=40次/分,吸呼比(I:E)均為1:2,FiO2=21％。機械通氣時間均為2h,機械通氣結(jié)束后給予去除機械通氣自主呼吸4h,之后處死動物。非機械通氣組在插管完

20、畢后6h處死動物。MSCs給予組均靜脈給予每只大鼠數(shù)量為3×106/L的MSCs,而未給予MSC組在插管2h后給予靜脈注射等體積生理鹽水(0.5ml)。動態(tài)觀察各組大鼠血氣變化、肺組織病理、對肺組織損傷進行評分(Smith評分)、肺組織內(nèi)PMN浸潤數(shù)量、BALF中PMN數(shù)量、BALF及循環(huán)中促炎因子(TNF—α、IL-6、MIP-2)及抗炎因子(IL—10)的變化情況,并將以上指標(biāo)進行組間比較。
　　 結(jié)果：1)機械通氣各組(包

21、括VT20組、MSC+VT20組及VT20+MSC組)在機械通氣后動脈血PaO2較T0時下降,組內(nèi)差異只有VT20組有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.001、0.359、0.147)；機械通氣后MSC+VT20組各時點PaO2均較VT20組增高,但只有T2時差異才有統(tǒng)計學(xué)意義(T2、T4及T6,P分別為0.035、0.050、0.053)。2)給予MSC對正常大鼠肺部病理組織無顯著影響,而VT20可導(dǎo)致大鼠肺部出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫、PMN浸潤,肺泡腔

22、內(nèi)出現(xiàn)大量的血性液體滲出、且肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)以PMN為主的細(xì)胞滲出,部分肺組織實變及肺泡出血等損傷改變。而MSC+VT20組肺組織病理僅見部分肺間質(zhì)稍增厚及較少量PMN浸潤,而VT20+MSC組部分肺間質(zhì)進一步增厚、PMN浸潤明顯減少等改變。肺損傷評分組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.131,P=0.000)。而肺組織病理高倍視野下PMN數(shù)量、BALF中PMN計數(shù)量組間差異同樣也有統(tǒng)計學(xué)意義(肺組織:F=43.039,P=0.000；BALF

23、:F=134.171,P=0.000)。3)各組動物BALF中TNF-α、IL-6、MIP-2及IL-10的濃度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(TNF-α:F=69.706,P=0.000；IL-6:F=155.816,P=0.000；MIP-2:F=120.529,P=0.000；IL-10:F=42.154,P=0.000),其中VT20組BALF中TNF—α、IL-6、MIP-2及IL-10的濃度均較對照組高,且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=

24、0.000)；MSC+VT20組BALF中TNF-α、IL-6、MIP-2濃度較VT20組低,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.000、0.025、0.009)；而VT20+MSC組與VT20組比較時,BALF的TNF-α、MIP-2水平組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.031、0.012),但組間BALF的IL-6差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.995)；此外,MSC+VT20組、VT20+MSC組的IL—10水平分別與VT20組IL-10

25、比較時,組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.117、0.556)。4)機械通氣損傷后(包括T2、T4、T6)大鼠血漿TNF-α、IL-6、MIP-2及IL-10的濃度均較T0時升高,且各指標(biāo)組內(nèi)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000),而MSC+VT20組機械通氣后(T4、T6)血漿TNF-α、IL-6、MIP-2的濃度較VT20組的低(TNF-α:P分別為0.000、0.003；IL-6:P分別為0.003、0.011；MIP-2:P分

26、別為0.997、0.002)；VT20+MSC組機械通氣后與VT20組比較時,T6時組間血漿TNF—α、MIP-α2的濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.039、0.033),而IL-6濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為1.000、0.469、0.978)。而MSC+VT20組、VT20+MSC組在機械通氣后血漿IL-10水平與同一時點的VT20組血漿IL-10水平比較,組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.804、0.995、1.000,

27、0.557、1.000、0.966)。
　　 結(jié)論：MSCs給予可在不同程度上減輕大潮氣量機械通氣所致的肺部組織損傷、氧合惡化、肺部PMN浸潤、局部及全身與PMN有關(guān)的炎癥介質(zhì)的釋放量,且MSCs給予時間越早,這些作用就越明顯；但MSCs給予但對VILI模型抗炎介質(zhì)IL-10的釋放量無顯著影響。MSCs使用在降低肺損傷程度的同時也伴隨著肺部浸潤PMN數(shù)量的降低。這提示MSCs輸注可為VILI模型提供一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境,這有助于

28、提高動物對不當(dāng)機械通氣的耐受程度及防治VILI后繼的以PMN為主的炎癥及其所致的肺部進一步損傷。
　　 第四章、MSC處理對VILI大鼠PMN功能的影響
　　 目的：明確MSC對VILI模型SD大鼠PMN功能的影響。
　　 方法：將對照組(control組)、MSC給予組(MSC組)、大潮氣量機械通氣組(VT20組)、MSCs預(yù)給予+大潮氣量機械通氣組(MSC+VT20組,在大潮氣量機械通氣前給予MSCs)、大潮

29、氣量機械通氣+MSCs后給予組(VT20+MSC組,在大潮氣量機械通氣結(jié)束后立即給予MSCs)大鼠在機械通氣后4h后取的血標(biāo)本及處死后取BALF的標(biāo)本,用流式細(xì)胞儀檢測其中PMN的細(xì)胞內(nèi)ROS含量及表面分子CD11b的表達；分離血標(biāo)本、BALF標(biāo)本中的PMN,用流式細(xì)胞術(shù)進行凋亡率檢測；利用化學(xué)發(fā)光法進行血漿、BALF中NE活性定量檢測；用Fenton反應(yīng)檢測血漿及BALF中的ROS(·OH含量),以確定細(xì)胞外bROS含量；并將NE活性

30、、細(xì)胞表面CD11b表大量、細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞外ROS含量、PMN細(xì)胞凋亡率資料進行組間比較。
　　 結(jié)果：1)血及BALF中PMN細(xì)胞表面CD11b表達量組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(血:F=1.008,p=0.442；BALF:F=0.328,p=0.856)。2)血及BALF中NE活性各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F分別為39.813、31.061,均P=0.000)。其中VT20組血及BALF中NE活性均較對照組高,差異有統(tǒng)計學(xué)

31、意義(均P=0.000);MSC+VT20組血及BALF中NE活性均較VT20組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000):且VT20+MSC組與VT20組組間血及BALF中的NE活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(血:P=0.035,BALF:P=0.040)；但MSC+VT20組與VT20+MSC組組血漿及BALF的NE活性間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(血:P=0.927,BALF:P=1.000)。3)血及BALF中PMN內(nèi)ROS含量各組間差異均有統(tǒng)計

32、學(xué)意義(F分別為986.470、118.612,均P=0.000)。VT20組血及BALF中PMN內(nèi)ROS含量較對照組增高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000); MSCs使用組(包括MSC+VT20組、VT20+MSC組)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量均較VT20組低,與VT20組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(除BALF中MSC+VT20組與VT20組比較P=0.001外,其它均P=0.000)；且MSC+VT20組、VT20+MSC組比較時,組間BA

33、LF來源的PMN內(nèi)ROS含量的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。4)血漿及BALF中ROS含量各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F分別為19.597、198.991,均P=0.000)。其中VT20組血漿及BALF中ROS含量均較對照組低,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000);MSC+VT20組血漿及BALF中的ROS含量較VT20組降低,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000)；而VT20+MSC組只有BALF中ROS含量較VT20

34、組低,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；且MSC+VT20組、VT20+MSC組比較時,血漿、BALF中ROS含量組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.001、0.021)。5)血及BALF來源的PMN細(xì)胞凋亡率各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F分別為41.869、89.661,均P=0.000)。其中VT20組血及BALF來源的PMN凋亡率均較對照組降低,且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000)；而MSC給予組中只有MSC+VT20組血

35、中PMN的凋亡率較VT20組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。
　　 結(jié)論：大潮氣量機械通氣所致的肺損傷大鼠模型中存在PMN的過度激活,其主要表現(xiàn)在NE活性增高、細(xì)胞內(nèi)外ROS產(chǎn)量增加、細(xì)胞凋亡減少及延遲等。而MSCs的給予在不同程度上降低NE活性及ROS的產(chǎn)生量,尤其是損傷前給予MSCs時PMN功能激活相關(guān)指標(biāo)降低量更為明顯。這表面MSCs有調(diào)節(jié)PMN功能的能力,且MSC給予時間越早則對PMN功能調(diào)節(jié)作用越明顯。

36、　　 第五章、MSC靜脈輸注對于VILI模型預(yù)后的影響及MSCs輸注后在肺部轉(zhuǎn)化情況觀察
　　 目的：明確MSCs靜脈內(nèi)注射能否改善VILI模型的預(yù)后與及其是否能遷移到VILI大鼠的肺部、替代損傷組織細(xì)胞、甚至獲得肺部損傷細(xì)胞的表型及發(fā)揮相應(yīng)功能。
　　 方法：取45只體重為250～260g的成年雌性SD大鼠麻醉、氣管切開插管后隨機分為大潮氣量機械通氣組b(VT20組b)、MSCs預(yù)給予+大潮氣量機械通氣組(MSC+V

37、T20組b,在大潮氣量機械通氣前給予MSCs)、大潮氣量機械通氣+MSCs后給予組(VT20+MSC組b,在大潮氣量機械通氣結(jié)束后立即給予MSCs),各組n=15,機械通氣組機械通氣參數(shù)為:VT=20 ml/kg體重,PEEP=2 cm H2O,RR=40次/分,吸呼比(I:E)為1:2,吸入氣氧濃度(FiO2)為21％,機械通氣時間為2h。機械通氣結(jié)束后拔除呼吸機接頭、縫合頸部切口后放置回實驗籠中,讓動物自主呼吸空氣。在隨后的14d內(nèi)

38、每24h觀察并記錄一次動物的存亡情況。取6只體重相近的成年雌性SD大鼠作MSC長期觀察組(MSC組b)經(jīng)尾靜脈注射MSCs,之后放回養(yǎng)殖籠中繼續(xù)養(yǎng)殖14d。MSCs均為雄性大鼠來源的,數(shù)量均為3×106/L每只大鼠。取MSC組、MSC+VT20組、VT20+MSC組、MSC組b、MSC+VT20組b及VT20+MSC組b動物各6只處死后取肺行免疫組織化學(xué)檢測抗SRY抗體陽性的細(xì)胞、PCR檢測肺組織中大鼠Y染色體上的Sry基因片段以明確靜

39、脈注射雄性大鼠來源的MSCs后是否能滯留在肺部、較長時期后肺部是否有雄性大鼠來源的細(xì)胞存在及其存在的部位。
　　 結(jié)果：MSC+VT20組b、VT20+MSC組b及VT20組b動物致傷后48h內(nèi)生存率分別為73.33％、73.33％、66.67％,三組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X2=0.216,P=0.897)；14d內(nèi)生存率分別為53.33.00％、40.00％、40.00％,各組動物14d內(nèi)死亡率差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(X2=0.7

40、20,P=0.698)。免疫組化、PCR結(jié)果提示MSCs輸注后短期實驗結(jié)束時各組動物均有MSCs滯留在肺部,其中在MSC組MSCs較均勻分布在肺毛細(xì)血管床內(nèi)；而MSC+VT20組MSCs分布較MSC組較為局限,量較MSC組少,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；而VT20+MSC組MSCs則分布在肺間質(zhì)明顯增厚的毛細(xì)血管床內(nèi),分布成片帶狀,量較MSC+VT20組要少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。而在MSC輸注后14d后MSC組

41、b、MSC+VT20組b及VT20+MSC組b三組動物的肺組織中均未檢出抗Y染色體特異性結(jié)合蛋白抗體陽性細(xì)胞及Y染色體Sry片段。
　　 結(jié)論：MSCs靜脈內(nèi)輸注短期內(nèi)可出現(xiàn)在VILI動物肺部,而組織損傷可減少MSCs在肺部的滯留數(shù)量,而MSCs并未移植到肺部、也未分化為肺部細(xì)胞并取代損傷細(xì)胞的功能。MSC細(xì)胞靜脈內(nèi)輸注雖可將VILI大鼠14d生存率從40％提高到53.33％,但由于例數(shù)較少,仍需進一步擴大樣本方可確認(rèn)MSCs干

42、預(yù)能否改善VILI模型14d內(nèi)生存率。
　　 全文總結(jié)：利用密度梯度離心法聯(lián)合離心法可分離、體外培養(yǎng)出增殖能力強、純度高、分化能力強、性狀穩(wěn)定的MSCs。而大潮氣量短期機械通氣可制備VILI模型,該模型病理上以PMN肺部浸潤增加為主要特征,同時伴隨與PMN相關(guān)的局部及全身炎癥反應(yīng)。在VILI大鼠模型中進行靜脈內(nèi)輸注MSCs可減輕VILI大鼠繼發(fā)的以PMN肺部浸潤及PMN功能激活在內(nèi)的炎癥反應(yīng)及肺損傷,而使用時機越早其保護作用越明