Ubiquitin-like家族蛋白溶液結(jié)構(gòu)與分子作用機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)翻譯后修飾是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的重要手段之一，涉及到蛋白質(zhì)降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色體裝配、DNA損傷修復(fù)等重要的生物學(xué)功能。目前已知的翻譯后修飾包括磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化、甲基化等。在這些翻譯后修飾中，泛素蛋白家族包含大約十幾種相關(guān)的蛋白質(zhì)，目前研究比較透徹的是泛素(ubiquitin)蛋白和SUMO(small ubiquitin-likeproteins)蛋白。我們的研究工作主要集中在兩個(gè)方面：一個(gè)是錐體蟲Trypanosom

2、a brucei中SUMO蛋白(Tb-SUMO)的溶液結(jié)構(gòu)和人Ubc9的相互作用；另一個(gè)是原核生物中ubiquitin蛋白(Pup)的溶液結(jié)構(gòu)及與Mpa相互作用的研究。
　　 錐體蟲Trypanosoma brucei是一種古老的單細(xì)胞的原生生物，主要寄生在人和牛的體內(nèi)，造成人的嗜睡病和牛的那加那病。我們實(shí)驗(yàn)室的廖善暉同學(xué)通過(guò)RNAi的方法證明了SUMO蛋白在錐體蟲中細(xì)胞有絲分裂中起重要作用。我們利用核磁共振方法研究Trypan

3、osoma brucei中SUMO蛋白的三維溶液結(jié)構(gòu)，這是第一個(gè)被解析出來(lái)的原生生物中SUMO蛋白的溶液結(jié)構(gòu)。通過(guò)核磁的溶液結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，Tb-SUMO的溶液結(jié)構(gòu)具有典型的ubiquitin折疊構(gòu)像，由5個(gè)β折疊和兩個(gè)α螺旋組成。與其他已知的SUMO蛋白結(jié)構(gòu)相比，Tb-SUMO蛋白在氨基端含有一段較長(zhǎng)的無(wú)規(guī)卷曲序列，長(zhǎng)度達(dá)到32個(gè)氨基酸殘基。為了研究Tb-SUMO和E2酶的相互作用，我們用化學(xué)微擾的方法研究了Tb-SUMO與人E2(Tr

4、ypanosomabrucei中的E2酶尚未找到)酶Ubc9的相互作用界面，發(fā)現(xiàn)Tb-SUMO與Ubc9的主要相互作用界面集中在β片層上，相互作用方式主要以疏水相互作用和靜電相互作用為主。通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)錐體蟲中的SUMO蛋白在結(jié)構(gòu)和Ubc9的結(jié)合方式在進(jìn)化上是保守的。
　　 Ubiquitin蛋白在真核生物中可以作為信號(hào)分子介導(dǎo)蛋白質(zhì)到蛋白酶體中進(jìn)行水解。已知在結(jié)核桿菌中有蛋白酶體復(fù)合物，但是一直以來(lái)在原核生物中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似

5、ubiquitin介導(dǎo)蛋白水解的方式，直到2008年人們首次在結(jié)核桿菌中發(fā)現(xiàn)了原核生物的ubiquitin蛋白(Pup)。并確定了Pup蛋白在結(jié)核桿菌中介導(dǎo)底物蛋白的水解。Pup是一個(gè)由64個(gè)氨基酸編碼的小蛋白質(zhì)，與真核生物中ubiquitin蛋白一樣，在Pup的羧基端含有兩個(gè)連續(xù)的甘氨酸殘基。我們通過(guò)Pup與真核生物中ubiquitin的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它與真核中ubiquitin蛋白的序列同源性非常低，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也顯示其具有不同于真核

6、ubiquitin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在實(shí)驗(yàn)方面我們利用CD和NMR方法顯示Pup是一個(gè)天然無(wú)規(guī)蛋白(IDP)，1H-15N NOE和CSI方法顯示在Pup的羧基端有一些殘留的二級(jí)結(jié)構(gòu)。之后我們利用NMR方法確定了Pup蛋白中各氨基酸的化學(xué)位移，同時(shí)我們用SPR方法和化學(xué)微擾的方法研究了Pup蛋白與Mpa(mycobacterium proteasomal ATPase)蛋白的相互作用。Mpa是原核生物中蛋白酶體的具有ATPase功能的一個(gè)

7、調(diào)節(jié)亞基，它能夠與Pup相互作用把底物帶到蛋白酶體中進(jìn)行水解。研究結(jié)果表明Pup和Mpa是一種強(qiáng)疏水相互作用，作用區(qū)段主要集中在羧基端的30-59的氨基酸區(qū)域。同時(shí)我們還在進(jìn)化角度上用進(jìn)化樹對(duì)Pup蛋白的進(jìn)化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Pup蛋白是一個(gè)在進(jìn)化樹上獨(dú)立的分支，這也可以解釋為什么Pup蛋白的結(jié)構(gòu)與真核的ubiquitin結(jié)構(gòu)有很大的差別。這是在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)的原核生物中ubiquitin的蛋白是一個(gè)天然無(wú)規(guī)蛋白質(zhì)，這個(gè)研究為后續(xù)的原核中u